Как выкинуть из лаборатории ванночку с гелем: наш чип, наши грабли и просьба к тем, кто в теме
Привет, Пикабу. Нас трое, мы студенты физфака МГУ — кафедра биофизики и кафедра общей физики и волновых процессов. Полтора года мы в свободное от учёбы время делаем прибор, который должен убрать из лабораторной рутины одну очень надоевшую процедуру. Сейчас у нас есть работающие чипы, зафиксированное разделение ДНК и куча набитых шишек. Расскажем и про то, и про другое — включая места, где мы облажались.
В конце будет ссылка на короткий опрос. Если вы работаете в лаборатории и хоть раз в жизни заливали гель — он для вас, и он нам реально нужен. Но сначала по делу.
Что вообще за гель и почему он всех бесит
Гель-электрофорез — это способ разделить смесь молекул ДНК по размеру. Заливаешь пластину агарозного геля (по сути — плотное желе с порами), кладёшь в ванночку с буфером, вносишь пробы в лунки, подаёшь напряжение. ДНК заряжена отрицательно и ползёт к плюсу, продираясь через поры. Короткие фрагменты проскакивают быстрее, длинные тормозят. Через какое-то время красишь, светишь ультрафиолетом, смотришь на полоски и говоришь: «ага, вот мой продукт ПЦР, размер примерно такой».
Метод придуман давно, работает надёжно и стоит в каждой молбиологической лаборатории мира. Проблема не в физике, а в эргономике:
Долго. Полный цикл — порядка 2–2,5 часов: расплавить агарозу, залить, дождаться застывания, нанести пробы, прогнать, покрасить, сфотографировать.
Руками. Из этих двух часов около часа — непосредственная работа человека с квалификацией, который в это время не делает науку.
Субъективно. «Полоса примерно вот тут» — на глаз. Точность оценки размера в рутинной практике — десятки пар нуклеотидов.
Грязно. Открытая ванна с ампликонами — это то, чем потом заражается вся комната. В нормальных лабах под это выделяют отдельное помещение.
Переделки. Пузырь под гребёнкой, перегрев, кривая заливка — и прогон в мусор.
Отдельно скажем честно: последний пункт мы в презентации оценивали как «примерно каждый четвёртый прогон». Это наша внутренняя оценка по опросу знакомых лаборантов, а не опубликованная статистика. Собственно, одна из причин, почему мы и запускаем опрос — хотим заменить ощущения на цифры.
Что мы делаем
Компактный прибор размером с настольный принтер плюс одноразовый микрофлюидный чип с уже залитым внутрь гелем. Пользователь достаёт чип из упаковки, вносит 1–2 мкл пробы, вставляет в прибор, жмёт «старт». Через ~15 минут получает картинку и цифры: какие фрагменты, какого размера. Без плавления агарозы, без ванночки, без УФ-стола, без окрашивания вручную.
Четыре блока внутри:
синий светодиодный источник, возбуждающий флуоресцентный краситель;
слот под одноразовый чип с предзалитым гелем;
оптика и камера, снимающие свечение;
софт, который из видео делает электрофореграмму и считает размеры фрагментов.
Почему на чипе быстрее — это физика, а не маркетинг
Тут самое интересное, и это не «мы придумали волшебство».
Первое: напряжённость поля. Скорость миграции ДНК определяется полем E = U/L. В классическом геле дорожка длиной ~8–10 см при 100 В даёт ~10 В/см. Если сделать канал разделения длиной 1–2 см, то те же 100–200 В дают уже десятки-сотни В/см. Разделение ускоряется на порядок просто по геометрии.
Второе: почему так нельзя сделать в обычном геле. Мешает джоулев нагрев. Выделяемая мощность на единицу объёма ∝ σ·E², где σ — проводимость буфера. В большом объёме геля тепло некуда девать: гель плывёт, полосы размазываются, ДНК деградирует. В микроканале отношение поверхности к объёму огромное, тепло уходит в подложку — и высокое поле становится допустимым. Именно на этом построены и Agilent Bioanalyzer, и TapeStation.
Третье, контринтуитивное. Обычно кажется, что «быстрее = грязнее». Здесь наоборот. Диффузионное размытие полосы растёт как σ ∝ √(2Dt) — то есть по времени. Чем быстрее прогон, тем меньше молекула успевает расплыться и тем уже полоса. Быстрый электрофорез при прочих равных даёт лучшее разрешение, а не худшее.
Четвёртое: гель залит заранее. Это убирает и 30–40 минут подготовки, и главный источник разброса между экспериментами — руки конкретного человека в конкретный день.
Что уже работает
Чипы печатаются. MSLA-печать фотополимерной смолой, каналы формируются сразу, без литографии и без чистой комнаты. Себестоимость прототипа — десятки рублей, итерация от правки в CAD до чипа в руках — часы, а не недели. Для стартапа на студенческие деньги это решающий фактор.
Разделение ДНК получено. Реальное, воспроизводимое, на фрагментах порядка 600 п.н.
Флуоресценция регистрируется на прототипе оптики.
Собран блок высокого напряжения собственной разработки (до 10 кВ, управление с микроконтроллера, цифровой потенциометр в обратной связи).
Чего ещё нет — говорим честно
Мы не будем писать «прибор готов». Не готов.
Финального блока детекции (камера + оптический тракт в корпусе) — нет, собран лабораторный вариант на столе.
Количественной калибровки по концентрации и алгоритмов оценки целостности (аналоги DIN/RIN) — нет. Пока мы умеем говорить «размер такой», но не «концентрация такая». Поэтому геномные центры и NGS-подготовку мы из ближайших планов честно вычеркнули: туда без валидированной количественной точности лезть нечего.
Промышленного корпуса и серийной сборки — нет.
Регистрации как медизделия — нет и не будет в ближайшее время. Первая версия идёт как научное оборудование, для исследовательских задач.
Сейчас идут первые пилотные тесты на реальных задачах в двух российских биотех-компаниях. Не в качестве «одобренного прибора», а в качестве «давайте посмотрим, что он вообще покажет на ваших образцах».
Раздел «грабли», ради которого вы, наверное, и дочитали
Грабля №1: мы ошиблись в расчёте нагрева в 10 раз. Считали джоулев нагрев в канале, получили ~8 К при рабочем напряжении и полдня грустили — это много, гель поплывёт. Потом перепроверили исходные данные. Оказалось, взяли проводимость TAE-буфера 0,25 См/м вместо реальных ~0,08 См/м, плюс забыли учесть извилистость путей в агарозном геле. Пересчёт дал ~0,2 К. Вывод банальный, но выстраданный: сначала проверь табличную константу, которую ты взял из головы, потом расстраивайся.
Грабля №2: «синие» светодиоды не синие. Для возбуждения флуоресценции нужен узкий синий ~470 нм. Взяли дешёвую синюю светодиодную ленту. Сигнал утонул в фоне. Собрали самодельный спектрометр из DVD-диска и посмотрели спектр: у ленты — люминофорный светодиод с широченным хвостом в районе 560 нм. Этот хвост проходит через оранжевый эмиссионный фильтр напрямую, минуя всю физику флуоресценции, и засвечивает камеру. Нужен настоящий InGaN-кристалл ~470 нм плюс возбуждающий полосовой фильтр перед образцом. Два фильтра, не один.
Грабля №3: смола трескалась, и виновата была не экспозиция. Чипы после печати покрывались микротрещинами. Мы месяц крутили время экспозиции. Помогло другое: сократить время замачивания в изопропаноле и как следует высушить деталь до финальной УФ-засветки. Плюс каналы забивались невымытой смолой — лечится ориентацией печати и принудительной продувкой каналов шприцем с ИПС до дозасветки, а не после.
Приятная неожиданность: прозрачная смола, которую мы используем, заметно светится сама под ультрафиолетом — и мы думали, что это приговор. Проверили под синим — не светится. Так как наша схема детекции построена на синем возбуждении, проблема снялась сама. Иногда везёт.
Про деньги и «зачем это вообще»
До 2022 года эту задачу в российских лабораториях закрывали импортные автоматические системы — Agilent TapeStation и Bioanalyzer, QIAGEN QIAxcel. Прибор стоил от 2,5 млн рублей, один анализ на фирменном расходнике — тысячи рублей. Сейчас с поставками и сервисом всё сложно, и лаборатории массово вернулись к ручным гелям в ванночке.
Наш план по цене — порядка 500 тыс. руб. за прибор и расходник в пределах сотен рублей за чип. Это план, а не прайс: серийной цены пока нет, потому что нет серии. Врать не будем.
И, если честно, главный конкурент у нас не Agilent, которого в стране почти нет. Главный конкурент — ванночка с агарозой и человек с пипеткой, которые работают всегда и стоят дёшево. Убедить лабораторию отказаться от них можно только скоростью и воспроизводимостью, а не рассказами про то, что мы дешевле американского прибора, которого у них и так нет.
А теперь просьба
Мы упёрлись в вещь, которую нельзя решить расчётом: мы не знаем реальных цифр по рутине в чужих лабораториях. Сколько прогонов в неделю. Сколько из них переделывают и почему. Кто в организации решает, что купить. Какая сумма проходит без тендерной эпопеи. Что важнее — скорость, точность или чтобы просто не возиться.
Мы собрали короткий опрос — 5 минут, без регистрации, без сбора персональных данных. Он для тех, кто реально работает с электрофорезом: молбиологи, генетики, сотрудники диагностических и производственных лабораторий, аспиранты, лаборанты, преподаватели практикумов.
Если вы не из сферы — не проходите, пожалуйста: вы нам испортите выборку, а мы по ней будем принимать решения. Лучше киньте ссылку знакомому, который жалуется на гели. Это поможет сильнее.
А в комментариях с удовольствием ответим на технические вопросы — про поля, буферы, печать, оптику, что угодно. И на «да кому это надо» тоже ответим, если аргументированно.
Спасибо, что дочитали.
Compact-Lab,
