Серия «Новости науки»

Чтобы изучить нейронные механизмы этого явления, команда Захари Пеннингтона и Дениз Кай из Медицинской школы Икана при Маунт-Синай исследовала поведение мышей после сильного стрессового воздействия.

В первой части эксперимента животные получали серию из десяти ударов электрическим током через пол. Контрольную группу помещали в ту же обстановку, но без ударов. Через десять дней обе группы подвергали воздействию громкого звука, который был значительно слабее первоначального стрессора.

Мыши, ранее пережившие удары током, демонстрировали более выраженное замирание в ответ на звук. Такое поведение служило показателем защитной реакции. Следовательно, предшествующий стресс изменял реакцию животных на последующее воздействие, даже когда оно не было сопоставимо по интенсивности с первоначальным событием.

Роль переднего ядра гипоталамуса

Чтобы выяснить, какие участки мозга участвуют в этом эффекте, исследователи сначала сопоставили активность различных областей мозга у животных с разным стрессовым опытом. Одной из областей, особенно активно реагировавших на последующий стресс у ранее подвергавшихся ему мышей, оказалось переднее ядро гипоталамуса — anterior hypothalamic nucleus (AHN).

Гипоталамус известен участием в регуляции физиологических процессов, включая температуру тела, сон и автономные реакции организма. Переднее ядро гипоталамуса также связывали с защитным поведением, однако его роль в длительных изменениях чувствительности к стрессу была изучена значительно хуже.

Затем учёные использовали миниатюрные микроскопы для регистрации активности отдельных нейронов AHN у свободно передвигавшихся мышей. Оказалось, что активность определённых нейронов менялась в зависимости от эмоциональной валентности событий: неприятные стимулы вызывали более выраженную реакцию, тогда как положительные сигналы могли её подавлять. После предыдущего стрессового опыта увеличивалась доля нейронов, чувствительных к отрицательной валентности.

Это наблюдение согласуется с предположением, что предыдущий стресс изменяет обработку информации о неприятных событиях. В результате последующий стрессор может вызывать более сильную защитную реакцию.

Миндалина связана с усилением стрессовой реакции

Следующий вопрос заключался в том, какие сигналы поступают в переднее ядро гипоталамуса. Исследователи обнаружили функционально значимую связь между ним и миндалиной — группой структур, участвующих в обработке эмоционально значимой информации и организации реакций на угрозу.

Чтобы проверить причинную роль этой связи, учёные вмешивались в активность нейронов. Подавление активности переднего ядра гипоталамуса ослабляло защитные реакции на стрессовые стимулы. Напротив, повышение его активности усиливало такие реакции.

Затем исследователи избирательно подавили сигналы, поступающие из миндалины в переднее ядро гипоталамуса. После этого эффект сенситизации к стрессу исчезал: предыдущий стресс уже не приводил к усиленной реакции на последующий раздражитель в условиях эксперимента.

Эти вмешательства важны для интерпретации результатов. Простая регистрация активности мозга позволила бы установить лишь связь между работой определённой области и поведением. Избирательное изменение активности нейронов и их связей даёт более сильные основания считать, что исследуемая цепь действительно участвует в формировании наблюдаемого эффекта.

Последствия стресса и результаты

Авторы предполагают, что переднее ядро гипоталамуса участвует в регулировании сигналов отрицательной валентности, поступающих из миндалины. Предшествующий стресс изменяет работу этой системы: большее число нейронов начинает реагировать на неприятные стимулы, а последующие стрессовые события вызывают более выраженное защитное поведение.

Это не означает, что учёные обнаружили единственную причину повышенной чувствительности к стрессу. Реакции на угрозу формируются при участии распределённых нейронных сетей, а обнаруженная цепь представляет собой один из механизмов, который может влиять на их выраженность.

Есть и другое существенное ограничение: эксперименты проводились на мышах. Замирание в ответ на звук или другие стрессовые стимулы позволяет исследовать защитные реакции, но не воспроизводит всего комплекса психологических и физиологических особенностей человеческих тревожных расстройств или посттравматического стрессового расстройства.

Поэтому пока нельзя утверждать, что аналогичная цепь объясняет, почему у конкретного человека после травматического события развивается повышенная тревожность. Необходимо выяснить, насколько сходным образом работает эта система у людей и какую роль она играет в долговременных последствиях стресса.

Тем не менее исследование уточняет возможный механизм сенситизации: предыдущий стресс способен изменять работу нейронной цепи, которая участвует в оценке неприятных событий и организации защитных реакций. Это позволяет перейти от общего наблюдения о влиянии прошлого опыта на последующее поведение к экспериментальной проверке конкретных нейронных механизмов.

Это свойство оказалось исключительно полезным для нейронауки. Например, если экспрессировать ChR2 в нейроне, освещение клетки приводит к открытию канала, входящему катионному току и деполяризации мембраны. При подходящих параметрах стимуляции возникают потенциалы действия. Свет в таком случае становится способом управления электрической активностью генетически модифицированной клетки.

В 2005 году Edward Boyden, Feng Zhang, Ernst Bamberg, Georg Nagel и Karl Deisseroth показали, что ChR2 можно использовать для быстрого управления активностью нейронов. В их работе световые импульсы вызывали спайки с миллисекундной точностью. В последующие годы появились эксперименты с оптическим управлением нейронами непосредственно в мозге живых животных.

Так сформировалась современная оптогенетика — набор методов, позволяющих с помощью генетической модификации сделать определённые клетки чувствительными к свету и затем управлять их активностью оптическим воздействием.

Дело в том, что наблюдение за активностью нейронов само по себе не позволяет установить их причинную роль в поведении. Если во время страха активируется определённая группа клеток, из этого ещё не следует, что именно её активность вызывает страх. Аналогичная активность может быть следствием происходящего процесса или частью более крупной нейронной цепи; важно и то, что совершения некоего действия некоторые зоны нужно не активировать, а подавить.

Потому появление метода, позволяющего экспериментально вмешиваться, имело для нейронауки огромное значение. Исследователь может искусственно активировать определённую популяцию нейронов и посмотреть, изменится ли поведение. Может подавить её и проверить, нарушится ли исследуемый процесс. Электрическая стимуляция и фармакологические методы позволяли делать подобные эксперименты и раньше, но обладали существенными ограничениями по клеточной специфичности и временной точности.

На этом месте можно было бы закончить короткую новость о Нобелевской премии. Но с историей метода всё несколько сложнее.

Ещё в январе 2002 года Борис Земельман, Джорджия Ли, Минна Нг и Геро Мизенбёк опубликовали в Neuron статью Selective Photostimulation of Genetically ChARGed Neurons.

Уже по названию можно понять прекол.

Исследователи хотели получить нейроны, активность которых можно было бы контролировать светом после генетической модификации. Для этого они использовали компоненты зрительной системы дрозофилы: опсин NinaE, Gqα, аррестин-2 и ретиналь. NinaE вместе с ретиналем образовывал светочувствительный родопсин. После поглощения света запускался G-белковый сигнальный каскад, который в конечном счёте изменял мембранный потенциал и мог вызывать потенциалы действия.

Среди исследователей был филолог-приколист (иначе я не могу объяснить), поэтому систему назвали chARGe.

Её экспрессировали в первичной культуре нейронов гиппокампа крысы. Исследователи регистрировали активность клеток методом whole-cell current clamp и показали, что освещение трансфицированных нейронов увеличивает частоту их потенциалов действия. В отдельных условиях частота достигала 7,5 Гц. Ответ зависел от интенсивности света и его спектрального состава.

И это в 2002-м году. То есть за три года до публикации знаменитой статьи Бойдена и Дайссерота уже существовал экспериментальный метод, в котором генетически модифицированные нейроны активировались светом. Более того, авторы рассматривали chARGe как инструмент для исследования нейронных цепей.

В 2003 году Земельман, Неснас, Ли и Мизенбёк продолжили эту линию, опубликовав работу о фотохимическом управлении ионными каналами и генетически заданными популяциями нейронов. Поэтому исторически неверно представлять дело так, будто идея генетически адресуемой световой стимуляции нейронов появилась в лаборатории Дайссерота в 2005 году.

Понятно, что chARGe и ChR2 — не одно и то же. В chARGe свет запускал довольно сложный внутриклеточный каскад. Опсин активировал G-белок, тот запускал последующие реакции, менялось состояние внутриклеточных посредников, а уже затем возникало изменение электрической активности клетки.

А ChR2 — это непосредственно светоуправляемый катионный канал. Поглощение света меняет состояние самого белка, канал открывается, и через мембрану начинает течь ток.

Ключевым преимуществом выступает то, что данный метод позволяет управлять спайками с миллисекундной точностью. Для его работы требуется экспрессия одного основного светочувствительного белка, тогда как чардж представляла собой многокомпонентную сложную систему.

Поэтому статья 2005 года была важным технологическим шагом даже при том, что сама идея световой стимуляции генетически определённых нейронов появилась раньше.

Но была и ещё одна линия-предшественница. В 2004 году Matthew Banghart, Katharine Borges, Ehud Isacoff, Dirk Trauner и Richard Kramer опубликовали работу о светоуправляемых ионных каналах, позволявших удалённо контролировать возбуждение нейронов. Существовали и другие подходы к фотоконтролю нейронной активности, включая фотохимически управляемые соединения.

Поэтому к моменту работы Дайссерота уже существовал довольно большой набор отдельных технических решений. Не существовало только современной, простой и хорошо масштабируемой платформы, которая впоследствии стала стандартным инструментом нейронауки.

Потому успех ChR2 понятен. Исследования Хегеманна и Нагеля дали нейронауке необычный природный инструмент: белок, который сам преобразует свет в ионный ток. Работа Boyden, Zhang, Bamberg, Nagel и Deisseroth показала, что этот белок можно использовать для управления нейронами.

И это сложная история. Хегельманн и Нагель (с коллегами) открыли природный светоуправляемы ионный канал, Земельман, Ли, Нг, Мизенбёк первыми продемонстрировали генетически адресуемую световую стимуляцию нейронов. В работе 2005 года была описана современная оптогенетическая платформа.

Если добавить сюда дальнейшее применение и развитие технологии к нейронным цепям и поведению, то список исследователей становится ещё длиннее. Потому интересен состав нынешней Нобелевской тройки.

Мизенбёк, чья лаборатория в 2002 году продемонстрировала генетически заданную световую стимуляцию нейронов, лауреатом не стал.

Борис Земельман, первый автор той работы, тоже не стал.

Эдвард Бойден, один из авторов статьи 2005 года и один из разработчиков патентованной технологии, тоже не стал.

Научный метод может складываться годами из нескольких независимых решений. Один исследователь находит подходящий белок, другой показывает принцип работы, третий создаёт инструмент, четвёртый применяет его к живому организму, а затем десятки лабораторий превращают первоначальную демонстрацию в стандартный метод.

Есть и другая причина относиться к оптогенетике без излишнего восторга.

То, что метод позволяет вмешиваться в работу конкретных нейронов, не означает, что любой полученный поведенческий эффект является прямым доказательством функции этих нейронов.

Допустим, исследователь активирует определённую популяцию клеток и получает агрессивное поведение. Это устанавливает, что данное искусственное воздействие способно вызвать определённый поведенческий эффект при данных экспериментальных условиях. Но из этого ещё не следует, что естественная активность этой популяции является причиной агрессии в обычной ситуации.

Для такого вывода нужно учитывать интенсивность и временной паттерн стимуляции, специфичность экспрессии опсина, возможную активацию соседних клеток, физиологические последствия самой оптогенетической манипуляции и соответствие искусственно вызванной активности естественной.

Если в реальности у клетки не будет стимулов к активации, то она не активируется. Наличие специфического светочувствительного стимула — это очень специфическое условие. Специфичность — обоюдоострый серп, который должен быть настолько специфичным, чтобы соблюдать чистоту эксперимента, но который может вообще не так работать в природе.

Потому для фундаментальной нейронауки оптогенетика остаётся ценным методом. Именно специфичное контролируемое искусственное вмешательство и делает его таким полезным. А вот интерпретация результатов остаётся на совести исследователей и зависит от их компетенций и мозговитости. Инструмент не заменяет голову.

Клиническая перспектива тоже значительно сложнее лабораторного эксперимента. Необходимо доставить генетический материал в нужные клетки, добиться достаточно специфичной и стабильной экспрессии опсина, решить проблему доставки света в глубокие структуры, оценить иммунологические и другие долгосрочные последствия. Для человеческого мозга всё это становится существенно сложнее, чем в эксперименте на мыши.

И я бы с большой осторожностью относился к оптогенетическим исследованиям поведения. Это очень мощное, поэтому очень опасное оружие. Можно проверять, что произойдёт при активации или подавлении определённой нейронной популяции. Можно сопоставлять это вмешательство с регистрацией активности, фармакологическими манипуляциями и поведенческими измерениями. Можно исследовать, какие звенья нейронных цепей необходимы для определённых форм обучения, памяти, мотивационного поведения или реакции на угрозу.

Но психологическое понятие всё равно требует отдельной операционализации.

Если в эксперименте на мышах говорится о "страхе", нужно смотреть, какое именно поведение было принято за показатель страха. Если говорится о "мотивации", нужно смотреть, каким тестом она измерялась. Если говорится о "памяти", важно знать, какую именно форму памяти исследовали и какое вмешательство было произведено.

Вместо итога

Предлагаю:

1. Не забывать имена и фамилии целой плеяды исследователей, которые сделали возможной нынешнюю нобелевку.

2. Не обманываться и не заблуждаться на тему наших возможностей и ограничений.

3. Подписаться на ТГ.

4. Почитать статьи на сайте. У нас там вышел материал о 4E, немного о педологии в СССР и мы продолжаем разбирать исследования: вот разбор дофаминчика Робинсона и Берриджа 1998. А ещё мы будем готовить материалы о методологии психологии и смежных дисциплин в контексте оптогенетики.

5. Поддержать наш проект рублём.