user12036748

Привет, Пикабу. Нас трое, мы студенты физфака МГУ — кафедра биофизики и кафедра общей физики и волновых процессов. Полтора года мы в свободное от учёбы время делаем прибор, который должен убрать из лабораторной рутины одну очень надоевшую процедуру. Сейчас у нас есть работающие чипы, зафиксированное разделение ДНК и куча набитых шишек. Расскажем и про то, и про другое — включая места, где мы облажались.

В конце будет ссылка на короткий опрос. Если вы работаете в лаборатории и хоть раз в жизни заливали гель — он для вас, и он нам реально нужен. Но сначала по делу.

Что вообще за гель и почему он всех бесит

Гель-электрофорез — это способ разделить смесь молекул ДНК по размеру. Заливаешь пластину агарозного геля (по сути — плотное желе с порами), кладёшь в ванночку с буфером, вносишь пробы в лунки, подаёшь напряжение. ДНК заряжена отрицательно и ползёт к плюсу, продираясь через поры. Короткие фрагменты проскакивают быстрее, длинные тормозят. Через какое-то время красишь, светишь ультрафиолетом, смотришь на полоски и говоришь: «ага, вот мой продукт ПЦР, размер примерно такой».

Метод придуман давно, работает надёжно и стоит в каждой молбиологической лаборатории мира. Проблема не в физике, а в эргономике:

• Долго. Полный цикл — порядка 2–2,5 часов: расплавить агарозу, залить, дождаться застывания, нанести пробы, прогнать, покрасить, сфотографировать.

• Руками. Из этих двух часов около часа — непосредственная работа человека с квалификацией, который в это время не делает науку.

• Субъективно. «Полоса примерно вот тут» — на глаз. Точность оценки размера в рутинной практике — десятки пар нуклеотидов.

• Грязно. Открытая ванна с ампликонами — это то, чем потом заражается вся комната. В нормальных лабах под это выделяют отдельное помещение.

• Переделки. Пузырь под гребёнкой, перегрев, кривая заливка — и прогон в мусор.

Отдельно скажем честно: последний пункт мы в презентации оценивали как «примерно каждый четвёртый прогон». Это наша внутренняя оценка по опросу знакомых лаборантов, а не опубликованная статистика. Собственно, одна из причин, почему мы и запускаем опрос — хотим заменить ощущения на цифры.

Что мы делаем

Компактный прибор размером с настольный принтер плюс одноразовый микрофлюидный чип с уже залитым внутрь гелем. Пользователь достаёт чип из упаковки, вносит 1–2 мкл пробы, вставляет в прибор, жмёт «старт». Через ~15 минут получает картинку и цифры: какие фрагменты, какого размера. Без плавления агарозы, без ванночки, без УФ-стола, без окрашивания вручную.

Четыре блока внутри:

1. синий светодиодный источник, возбуждающий флуоресцентный краситель;

2. слот под одноразовый чип с предзалитым гелем;

3. оптика и камера, снимающие свечение;

4. софт, который из видео делает электрофореграмму и считает размеры фрагментов.

Почему на чипе быстрее — это физика, а не маркетинг

Тут самое интересное, и это не «мы придумали волшебство».

Первое: напряжённость поля. Скорость миграции ДНК определяется полем E = U/L. В классическом геле дорожка длиной ~8–10 см при 100 В даёт ~10 В/см. Если сделать канал разделения длиной 1–2 см, то те же 100–200 В дают уже десятки-сотни В/см. Разделение ускоряется на порядок просто по геометрии.

Второе: почему так нельзя сделать в обычном геле. Мешает джоулев нагрев. Выделяемая мощность на единицу объёма ∝ σ·E², где σ — проводимость буфера. В большом объёме геля тепло некуда девать: гель плывёт, полосы размазываются, ДНК деградирует. В микроканале отношение поверхности к объёму огромное, тепло уходит в подложку — и высокое поле становится допустимым. Именно на этом построены и Agilent Bioanalyzer, и TapeStation.

Третье, контринтуитивное. Обычно кажется, что «быстрее = грязнее». Здесь наоборот. Диффузионное размытие полосы растёт как σ ∝ √(2Dt) — то есть по времени. Чем быстрее прогон, тем меньше молекула успевает расплыться и тем уже полоса. Быстрый электрофорез при прочих равных даёт лучшее разрешение, а не худшее.

Четвёртое: гель залит заранее. Это убирает и 30–40 минут подготовки, и главный источник разброса между экспериментами — руки конкретного человека в конкретный день.

Что уже работает

• Чипы печатаются. MSLA-печать фотополимерной смолой, каналы формируются сразу, без литографии и без чистой комнаты. Себестоимость прототипа — десятки рублей, итерация от правки в CAD до чипа в руках — часы, а не недели. Для стартапа на студенческие деньги это решающий фактор.

• Разделение ДНК получено. Реальное, воспроизводимое, на фрагментах порядка 600 п.н.

• Флуоресценция регистрируется на прототипе оптики.

• Собран блок высокого напряжения собственной разработки (до 10 кВ, управление с микроконтроллера, цифровой потенциометр в обратной связи).

Чего ещё нет — говорим честно

Мы не будем писать «прибор готов». Не готов.

• Финального блока детекции (камера + оптический тракт в корпусе) — нет, собран лабораторный вариант на столе.

• Количественной калибровки по концентрации и алгоритмов оценки целостности (аналоги DIN/RIN) — нет. Пока мы умеем говорить «размер такой», но не «концентрация такая». Поэтому геномные центры и NGS-подготовку мы из ближайших планов честно вычеркнули: туда без валидированной количественной точности лезть нечего.

• Промышленного корпуса и серийной сборки — нет.

• Регистрации как медизделия — нет и не будет в ближайшее время. Первая версия идёт как научное оборудование, для исследовательских задач.

Сейчас идут первые пилотные тесты на реальных задачах в двух российских биотех-компаниях. Не в качестве «одобренного прибора», а в качестве «давайте посмотрим, что он вообще покажет на ваших образцах».

Раздел «грабли», ради которого вы, наверное, и дочитали

Грабля №1: мы ошиблись в расчёте нагрева в 10 раз. Считали джоулев нагрев в канале, получили ~8 К при рабочем напряжении и полдня грустили — это много, гель поплывёт. Потом перепроверили исходные данные. Оказалось, взяли проводимость TAE-буфера 0,25 См/м вместо реальных ~0,08 См/м, плюс забыли учесть извилистость путей в агарозном геле. Пересчёт дал ~0,2 К. Вывод банальный, но выстраданный: сначала проверь табличную константу, которую ты взял из головы, потом расстраивайся.

Грабля №2: «синие» светодиоды не синие. Для возбуждения флуоресценции нужен узкий синий ~470 нм. Взяли дешёвую синюю светодиодную ленту. Сигнал утонул в фоне. Собрали самодельный спектрометр из DVD-диска и посмотрели спектр: у ленты — люминофорный светодиод с широченным хвостом в районе 560 нм. Этот хвост проходит через оранжевый эмиссионный фильтр напрямую, минуя всю физику флуоресценции, и засвечивает камеру. Нужен настоящий InGaN-кристалл ~470 нм плюс возбуждающий полосовой фильтр перед образцом. Два фильтра, не один.

Грабля №3: смола трескалась, и виновата была не экспозиция. Чипы после печати покрывались микротрещинами. Мы месяц крутили время экспозиции. Помогло другое: сократить время замачивания в изопропаноле и как следует высушить деталь до финальной УФ-засветки. Плюс каналы забивались невымытой смолой — лечится ориентацией печати и принудительной продувкой каналов шприцем с ИПС до дозасветки, а не после.

Приятная неожиданность: прозрачная смола, которую мы используем, заметно светится сама под ультрафиолетом — и мы думали, что это приговор. Проверили под синим — не светится. Так как наша схема детекции построена на синем возбуждении, проблема снялась сама. Иногда везёт.

Про деньги и «зачем это вообще»

До 2022 года эту задачу в российских лабораториях закрывали импортные автоматические системы — Agilent TapeStation и Bioanalyzer, QIAGEN QIAxcel. Прибор стоил от 2,5 млн рублей, один анализ на фирменном расходнике — тысячи рублей. Сейчас с поставками и сервисом всё сложно, и лаборатории массово вернулись к ручным гелям в ванночке.

Наш план по цене — порядка 500 тыс. руб. за прибор и расходник в пределах сотен рублей за чип. Это план, а не прайс: серийной цены пока нет, потому что нет серии. Врать не будем.

И, если честно, главный конкурент у нас не Agilent, которого в стране почти нет. Главный конкурент — ванночка с агарозой и человек с пипеткой, которые работают всегда и стоят дёшево. Убедить лабораторию отказаться от них можно только скоростью и воспроизводимостью, а не рассказами про то, что мы дешевле американского прибора, которого у них и так нет.

А теперь просьба

Мы упёрлись в вещь, которую нельзя решить расчётом: мы не знаем реальных цифр по рутине в чужих лабораториях. Сколько прогонов в неделю. Сколько из них переделывают и почему. Кто в организации решает, что купить. Какая сумма проходит без тендерной эпопеи. Что важнее — скорость, точность или чтобы просто не возиться.

Мы собрали короткий опрос — 5 минут, без регистрации, без сбора персональных данных. Он для тех, кто реально работает с электрофорезом: молбиологи, генетики, сотрудники диагностических и производственных лабораторий, аспиранты, лаборанты, преподаватели практикумов.

👉 [ССЫЛКА НА ОПРОС]

Если вы не из сферы — не проходите, пожалуйста: вы нам испортите выборку, а мы по ней будем принимать решения. Лучше киньте ссылку знакомому, который жалуется на гели. Это поможет сильнее.

А в комментариях с удовольствием ответим на технические вопросы — про поля, буферы, печать, оптику, что угодно. И на «да кому это надо» тоже ответим, если аргументированно.

Спасибо, что дочитали.

Compact-Lab,