Транскрипция. Молекулярная биология. Часть 3⁠⁠

1. Транскриция

Экспрессия всех генов начинается с транскрипции их нуклеотидной последовательности, т.е. перевода ее на язык РНК. При этом определенный участок одной из двух цепей ДНК используется как матрица для синтеза РНК путем комплементарного спаривания оснований. В результате транскрипции генов, в которых закодирована структурная информация о белках, образуются молекулы мРНК; другие гены кодируют молекулы РНК, являющиеся частью аппарата, необходимого для трансляции мРНК с образованием белков. У прокариот, например Е. coli, ДНК транскрибируется с помощью одного фермента – ДНК-зависимой РНК-полимеразы, который участвует в синтезе всех типов РНК.

Коротко, для процесса транскрипции необходимо присутствие всех участников:

• Нуклеотиды (для роста цепи мРНК)

• Матрица – ДНК

• Ферменты транскрипции – РНК-полимеразы

Очень схематичная схема транскрипции:

Сам процесс принято делить на 3 этапа:

• Инициацию – выбор фиксированного места начала транскрипции (специфическое связывание РНК-полимеразы с матричной нитью), промотор

• Элонгацию – синтез РНК после оставления РНК-пол промотора

• Терминацию – окончание транскрипции, происходит на терминаторе

2. Работа РНК-полимеразы e.coli

РНК-полимеразы обладают нуклеотидил-трансферазной активностью. Они полимеризуют (присоединяют) рибонуклеотиды на 3’-конце.

Здесь стоит сделать небольшое отступление, молекулы РНК и ДНК имеют направленность (как дороги в городе имеют полосы). Направления важны для работы различных ферментов. Остов каждой из цепей состоит из чередующихся фосфатов и сахаров. Внутри одной цепи ДНК нуклеотиды соединены фосфодиэфирными связями, которые формируются в результате взаимодействия между 3'-гидроксильной (3'—ОН) группой молекулы дезоксирибозы одного нуклеотида и 5'-фосфатной группой (5'—РО3) другого. Асимметричные концы цепи ДНК называются 3' (три штрих) и 5' (пять штрих). Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК, так и РНК (удлинение цепи возможно только путём присоединения новых нуклеотидов к свободному 3'-концу).

Таким образом, 3'-конец это  ОН-конец, а 5'-фосфатный конец.

Теперь мы вроде определились с направлениями, осталось поставить на дороги машину (пока одну) и назовем ее РНК-полимераза.

РНК-полимераза e.coli транскрибирует все гены, которых у кишечной палочки аж 4200 штук. В клетке одновременно содержится до 7000 копий РНК-полимераз, а заняты своей работой от 2000-5000 полимераз.

РНК-полимераза состоит из 4х типов субъединиц, каждые из которых имеют собственные активности.

Интересно, что РНК-полимераза существует в виде двух состояний:

минимального фермента и полного фермента. Минимальный фермент, как машина без водителя, скорее всего свободно передвигается по ДНК в ожидании своего "водителя". (Состав минимального фермента, субъединицы (СЕ): 2  альфа, 1 бэта, 1 бэта'). Полный фермент отличается наличием в своем составе сигма СЕ (самой распространенной является сигма-70). Именно этот сигма-фактор и отвечает за правильную транскрипцию гена, а точнее за инициацию транскрипции именно на промоторе гена.

Кратко функции сигма-факторов:

• Обеспечивает узнавание промотора

• Физически связывается с промотором

• Участвует в плавлении промотора (плавление = разрыв нитей, тут образуется локальный разрыв, он же транскрипционный пузырек)

• Обеспечивает выбор матричной нити

• Запускает элонгацию (своим уходом)

Для каждого типа промотора существует свой сигма-фактор, это составляет основу регуляции экспрессии генов у e.coli.

Как же происходит узнавание промотора?

Помните, в прошлом посте, мы обсуждали структуру промоторных областей, так вот сигма-фактор узнает последовательности в положении -10 и -35 и связывается с ними. Это связывание намного крепче, чем связь с остальными частями ДНК. Таким образом РНК-полимераза приобрела своего водителя и наметила дальнейший путь.

*Рассмотрим процесс инициации транскрипции подробнее (тут уже немного жести).

• минимальная-РНК-полимераза слабо взаимодействует с любыми участками ДНК

• Образование полного-фермента ведет к образованию открытого комплекса

• Сродство комплекса полного фермента к ДНК вообще снижается, а к промотору повышается в 10000 раз

• При открытом канале участки активного центра РНК-полимеразы связываются с промотором во время линейной диффузии РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК

• Начальное связывание полного фермента с промотором приводит к образованию закрытого комплекса

• В нем пока еще двунитевая ДНК, которая некомпетентна к инициации транскрипции, а сигма-СЕ связана с обоими блоками промотора

• Переход из закрытого комплекса в открытый сопровождается напряженным состоянием ДНК (тут было бы хорошо представить себе телефонный шнур, еще от старых телефонов, который был спиральный) Подобно любой спирали ДНК способна образовывать суперскрученные участки. Сверхспирализация ДНК — явление пере- или недоскручивания топологически замкнутых цепей ДНК, в результате которого ось двойной спирали ДНК сама закручивается в спираль более высокого порядка. Отрицательная сверхспирализация способствует облегчению локального плавления двойной спирали, что обеспечивает нормальную инициацию транскрипции.

Таким образом сверхспирализация оказывает важный эффект на процессы транскрипции. Как показано на рисунке транскрибирование молекулы ДНК сопровождается расплетанием и последующим восстановлением двойной спирали. Следовательно, транскрипционный

комплекс должен иметь возможность вращаться вокруг молекулы ДНК либо сама ДНК должна вращаться вокруг своей оси. На рисунке изображены последствия считывания некого региона ДНК согласно модели транскрипции, получившей название модели двойного домена.

Двигаясь вдоль двойной спирали, РНК-полимераза формирует положительную сверхспирализацию впереди себя(участок ДНК как бы закручивается еще сильнее) и создает отрицательную сверхспирализацию за собой (формируя участок ДНК с частично расплетенными цепями). Для каждого витка спирали, развернутого РНК-полимеразой, впереди формируется 1 положительный сверхвиток, а позади формируется 1 отрицательный сверхвиток.

Как же сигма-факторы взаимодействуют с ДНК?

Как уже отмечалось ранее сигма-фактор взаимодействует с блоками -10 и -35 промоторных областей. Для этого стоит обратить внимание на строение сигма фактора.

На рисунке схематично представлено строение белка сигма-фактора, если вытянуть его в цепочку и каждому  региону приписать функции. Как показано на рисунке, два коротких сегмента регионов 2 и 4 (названные 2.4 и 4.2) участвуют во взаимодействии с промотором в районах -10 и -35 соответственно. Оба этих региона белка формируют небольшие альфа-спиральные участки (альфа-спирали - элемент вторичной структуры укладки белков). Использование белком альфа-спиральных участков для распознавания двухцепочечной ДНК является общим свойством всех сигма-факторов (такой мотив в белках называется спираль-поворот-спираль и часто используется у белков, контактирующих с ДНК). Регион 2.3 похож на белки, связывающие одноцепочечные нуклеиновые кислоты, и участвует в реакции расплетания ДНК. Регионы 2.1 и 2.2 (являющиеся наиболее консервативными участками сигма-фактора) вовлечены во взаимодействие с минимальным ферментом. Это позволяет предположить, что все сигма-факторы связывают минимальный фермент в одних и тех же участках, что обеспечивает конкуренцию между сигма-факторами за связь с полимеразой.

На этом я пока хочу закончить эту часть повествования, дальше мы поговорим о движении РНК-полимеразы по ДНК, и терминации.
Если есть вопросы, жду в комментах. Пожелания и советы там же.
Забыла порекомендовать отличный ресурс (не только биологам), где выложено много курсов по различным областям наук - coursera (надеюсь, что вы уже его знаете).