Нингидриновая реакция
Нингидрин (он же 2,2-дигидроксиинден-1,3-дион) – это и кетон, и спирт, и вещество с двумя углеродными циклами в структуре. Его используют, в том числе, для выявления первичных аминов, коими являются практически все (за некоторым исключением) аминокислоты, входящие в состав наших с вами (и не только) белков.
Структурная формула нингидрина
Как это происходит? Нингидрин, попадая в среду, где есть первичные амины, связывается с аминогруппой, а через несколько стадий образуется продукт конденсации – комплекс Руэмана или пурпур Руэмана. Механизм реакции с первичными аминами ниже:
Механизм нингидриновой реакции с первичными и вторичными аминами на примере аминокислот.
В реакции с пролином и гидроксипролином, у которых нет первичного амина в структуре, нингидрин дает желтое окрашивание (как видно на схеме реакции, можно получить и пурпурную, но чаще всего это не требуется.
Зачем нужна реакция первичных аминов с нингидрином? Очевидно, чтобы проявить эти самые амины, сделать их видимыми. Это хорошо помогает при выявлении, например, отпечатков пальцев. Мы помним, что аминокислоты входят в состав белков и, соответственно, белки с нингидрином тоже дают пурпурное окрашивание.
Чтобы проявить отпечатки пальцев, например, на пористой поверхности (бумага, дерево и т. д.), её можно обработать раствором нингидрина в форме спрея и потом нагреть в печи. Впрочем, те, кто ближе к криминалистике, лучше знают, как это делается, мне известен лишь общий принцип.
Это одно из применений нингидриновой реакции. Второе – качественное или количественное определение аминокислот в их смесях (или одной аминокислоты в препарате, например, в таблетках глицина).
Реализуется такое определение, в том числе, методом жидкостной хроматографии. Ниже хроматограмма разделения смеси стандартов аминокислот на катионообменной колонке с последующей реакцией кислот с нингидрином (это называется дериватизацией).
Разделение смеси стандартов аминокислот (стандарты Sigma-Aldrich)
Разделение аминокислот в образце зеленой массы
Пожалуйста, не обращайте внимание на не совсем корректное определение пиков. На этих хроматограммах еще не выполнено интегрирование, хотя практически все компоненты определились верно.
Детектирование ведется на длине волны 570 нм. Стоит отметить, что аминокислоты, не имеющие первичной аминогруппы, детектируются на длине волны 440 нм (это пролин и гидроксипролин).
Ниже видео, показывающее нингидриновую реакцию с раствором глицина трех разных концентраций (2 и 3 являются последовательными разведениями 1 в соотношении 1 : 1, объем : объем).
Я не делал навеску, но количество глицина, растворенное далее в 100 мл воды можно оценить по фото шпателя:
Местами видео ускорено в 5 и 50 раз соответственно.
В пробирке 3 изменение окраски вполне достаточно для обнаружения диодноматричным детектором.
Существует способ определения с предколоночной дериватизацией (если мы исключаем методики с обнаружением на МС) о-фталевым альдегидом (ОФА или OPA). Кто делает подобный анализ чаще, может подсказать, внесена ли эта методика в ГОСТ.
Не знаю, насколько интересен будет пост, но спасибо всем дочитавшим его до конца.