Окраска бактерий по Граму⁠⁠

В продолжение микробиологической темы - окраска бактериальных клеток по методике Грама. Текст дублирует комментарии в видео (вдруг у кого-то сию минуту нет возможности проиграть ролик, а приобщиться к образованию хочется).

В микробиологии широко применяются различные методы окраски бактерий. Конечно, можно производить наблюдение и без этих сложных манипуляций, но тогда при микроскопировании вы почти ничего не увидите, ведь коэффициент светопреломления бактерий близок к коэффициенту светопреломления жидкости, в которой они живут. Для того, чтобы бактерии или какие-то их внутренние или внешние структуры чётко выделялись на фоне, применяют различные красители. Сегодня мы рассмотрим методику окраски по Граму, разработанную в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

Исполнение методики начинается с приготовления фиксированного мазка культуры микроорганизмов. На предметное стекло наносится капля физиологического раствора, в которую микробиологической петлёй, прожжённой в пламени горелки, вносятся изучаемые бактерии. Это может быть как сиюминутный соскоб или мазок, так и заранее выращенная колония. Все этапы должны производиться в условиях асептики, желательно в зоне пламени горелки. Демонстрируемый способ выполнения методики призван лишь отразить последовательность внесения необходимых для окраски веществ и разъяснить роль каждого этапа.

Суть методики в визуальном разделении бактерий на две группы – грамположительные и грамотрицательные. Первые в итоге дифференциации выглядят под микроскопом как окрашенные в синий или фиолетовый цвет, а вторые – в розовый. Основная разница между ними в том, что грамотрицательные бактерии хуже воспринимают краситель из-за более сложного строения оболочки. В частности, у них имеется дополнительная мембрана поверх клеточной стенки, препятствующая проникновению ненужных веществ. При этом пептидогликановый слой у них тоньше, чем у грамположительных бактерий. Именно эти особенности позволяют им проявлять патогенность. В медицинской микробиологии почти не изучаются грамположительные бактерии, поскольку очень немногие из них способны вызывать болезни.

Нанесённый на стекло мазок высушивается на воздухе или высоко над пламенем горелки, чтобы не допустить закипания и денатурации белка, а затем фиксируется путём пронесения через пламя в течение короткого времени. Таким образом микроорганизмы погибают и надёжно приклеиваются к стеклу.

Теперь наступает время внесения красителя. Сперва происходит окраска генцианвиолетом. Это основной краситель трифенилметанового ряда: смесь пента- и гексаметилпараозанилинов с небольшим количеством декстрина и фуксина. Он используется в медицине не только как краситель, но и как антисептическое средство. Противомикробные свойства объясняются высокой проницаемостью сквозь бактериальные оболочки и воздействием на окислительно-восстановительные процессы.

Окраска длится 1-2 минуты, после чего генцианвиолет сливают и заливают образцы раствором Люголя. Это вещество, думаю, хорошо знакомо всем – им обрабатывают горло при ангине. Раствор Люголя – это соединение йода с йодидом калия, что придаёт ему хорошую водорастворимость. Соединяясь с кусочками генцианвиолета, который проник в клеточные стенки бактерий, йод образует прочное соединение сине-фиолетового цвета. Реакция тоже длится 1-2 минуты.

Теперь пришло время дифференциации, то есть разделения грамположительных и грамотрицательных бактерий. Для этого стекло с мазком несколько раз погружают в сосуд с 96%-ным этиловым спиртом до тех пор, пока стекающие капли не сравняются по цвету со спиртом в стакане. При этой процедуре сине-фиолетовый комплекс вымывается из стенок грамотрицательных бактерий, оставаясь только в стенках грамположительных.

Для того, чтобы грамотрицательные бактерии не казались бесцветными, мазок промывается водой и дополнительно окрашивается водным раствором фуксина в течение тех же магических 1-2 минут. Поскольку в стенке грамположительных бактерий уже есть краситель, они фуксином не окрашиваются. А грамотрицательные бактерии приобретают розовый цвет. Мазок окончательно промывается водой, высушивается и препарат готов к микроскопированию.

Грамотрицательные бактерии (х1600):

Грамположительные бактерии (х1600):

А вот и видео:

P.S.: Напоминаю, что более подробно с этой и многими другими темами вы можете ознакомиться в видеозаписях в группе ВКонтакте (https://vk.com/public137215775), на канале YouTube (https://www.youtube.com/channel/UCe0PmlsjVJrRoQlBKGXDi2g) и на канале Твича (https://www.twitch.tv/ademortuus), где по вторникам и четвергам мы читаем всякие научные лекции в 20:00 по МСК.