Статья с журнала Nature Medicine от 9 ноября 2015 года⁠⁠

Появление тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса (SARS-CoV) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS) -CoV подчеркивает угрозу межвидовых трансмиссивных событий, ведущих к вспышкам среди людей. Здесь мы изучаем потенциал заболевания SARS-подобным вирусом, SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяциях китайских подковообразных летучих мышей 1 . Использование системы обратной генетики SARS-CoV 2Авторы создали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий пик коронавируса летучей мыши SHC014 в адаптированном для мыши остове SARS-CoV. Результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие спайк SHC014 в позвоночнике дикого типа, могут эффективно использовать несколько ортологов человеческого ангиотензин-превращающего фермента II рецептора SARS (ACE2), эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro, эквивалентных эпидемическим. штаммы SARS-CoV. Кроме того, в естественных условияхэксперименты демонстрируют репликацию химерного вируса в легких мыши с заметным патогенезом. Оценка доступных иммунотерапевтических и профилактических методов на основе атипичной пневмонии показала низкую эффективность; подходы как к моноклональным антителам, так и к вакцинам не смогли нейтрализовать и защитить от инфицирования CoV с использованием нового белка с шипами. На основании этих результатов мы синтетически воспроизвели инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали надежную репликацию вируса как in vitro, так и in vivo . Наша работа предполагает потенциальный риск повторного появления SARS-CoV из вирусов, циркулирующих в настоящее время в популяциях летучих мышей.

Появление SARS-CoV ознаменовало новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и огромному экономическому воздействию 3 , 4 . С тех пор несколько штаммов, в том числе штаммы гриппа A H5N1, H1N1 и H7N9 и MERS-CoV, появились в популяциях животных, вызывая значительные заболевания, смертность и экономические трудности для пострадавших регионов 5 . Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку SARS-CoV 4 , недавние исследования в области метагеномики позволили выявить последовательности близкородственных SARS-подобных вирусов, циркулирующих в популяциях китайских летучих мышей, которые могут представлять угрозу в будущем 1 , 6., Однако одни только данные о последовательностях обеспечивают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемическим вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал появления (то есть возможность заражать людей) циркулирующих CoV у летучих мышей, мы создали химерный вирус, кодирующий новый, зоонозный белок-шип CoV - из последовательности RsSHC014-CoV, которая была выделена из китайских подковообразных летучих мышей 1 - в контексте SARS-CoV, адаптированной к мышам основной цепи. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового белка шипа вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном скелете. Используя этот подход, мы охарактеризовали CoV-инфекцию, опосредованную спайком белка SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo.и проверили эффективность доступных иммунных терапевтических средств против SHC014-CoV. Вместе эта стратегия переводит данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим возникающим вирусам.

Последовательности SHC014 и родственных RsWIV1-CoV показывают, что эти CoVs являются ближайшими родственниками эпидемических штаммов SARS-CoV ( Fig. 1a, b ); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор SARS-CoV, включая пять, которые являются критическими для диапазона хозяев: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (ссылка 7 ). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но не ожидалось, что они изменят связывание с ACE2 ( дополнительная рис. 1a, b и дополнительная таблица 1 ). Этот факт подтверждается обоими экспериментами с псевдотипированием, в которых измерялась способность лентивирусов, кодирующих белки спайка WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие ACE2 человека ( дополнительная фиг. 1).) и анализом репликации in vitro WIV1-CoV (ссылка 1 ). Напротив, 7 из 14 остатков взаимодействия ACE2 в SHC014 отличаются от остатков в SARS-CoV, включая все пять остатков, критических для диапазона хозяев ( дополнительная рис. 1c и дополнительная таблица 1 ). Эти изменения в сочетании с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих пик SHC014, проникать в клетки ( дополнительный рисунок 1d ), позволяют предположить, что пик SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Однако сообщалось, что аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют связывать ACE2 7 , 8., предполагая, что для проверки требуется дополнительное функциональное тестирование. Таким образом, мы синтезировали шип SHC014 в контексте компетентного к репликации адаптированного к мышам скелета SARS-CoV (далее мы будем называть химерный CoV как SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможность патогенеза и исследования вакцин на мышах ( дополнительная фиг.8). 2а ). Несмотря на предсказания как из структурного моделирования, так и из экспериментов с псевдотипированием, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero ( дополнительная фиг. 2b ). Подобно SARS, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологов ACE2 человека, циветты и летучей мыши ( дополнительная Рис. 2c, d). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность клеточной линии эпителия дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ссылка 9 ) к инфекции и обнаружили надежную репликацию SHC014-MA15, сравнимую с таковой у SARS-CoV Urbani ( рис. 1в ). Чтобы расширить эти результаты, первичные эпителиальные культуры дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали устойчивую репликацию обоих вирусов ( Fig. 1d ). Вместе данные подтверждают способность вирусов с шипом SHC014 инфицировать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.

Фигура 1: SARS-подобные вирусы реплицируются в клетках дыхательных путей человека и вызывают патогенез in vivo

( a ) Полноменные последовательности генома репрезентативных CoV были выровнены и филогенетически картированы, как описано в Online Methods . Масштабная линейка представляет нуклеотидные замены, причем только поддержка бутстрапа выше 70% помечена. Дерево показывает CoV, разделенные на три отдельные филогенетические группы, определяемые как α-CoV, β-CoV и γ-CoV. Классические кластеры подгрупп отмечены как 2a, 2b, 2c и 2d для β-CoV и как 1a и 1b для α-CoV. ( b ) Аминокислотные последовательности доменов S1 спайков репрезентативных β-CoV группы 2b, включая SARS-CoV, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала представляет аминокислотные замены. ( с , д) Вирусная репликация SARS-CoV Urbani (черный) и SHC014-MA15 (зеленый) после инфицирования клеток Calu-3 2B4 ( c ) или хорошо дифференцированных первичных воздух-жидкостных интерфейсных культур клеток HAE ( d ) при множественной инфекции (МВД) 0,01 для обоих типов клеток. Образцы собирали в отдельные моменты времени с биологическими повторностями ( n = 3) для экспериментов Calu-3 и HAE. ( e , f ) Потеря веса ( n = 9 для SARS-CoV MA15; n = 16 для SHC014-MA15) ( e ) и репликация вируса в легких ( n = 3 для SARS-CoV MA15; n = 4 для SHC014- MA15) ( ф) 10-недельных мышей BALB / c, инфицированных 1 × 10 4 БОЕ адаптированных к мыши SARS-CoV MA15 (черный) или SHC014-MA15 (зеленый) через интраназальный (in) путь. ( g, h ) Представлены репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на антиген SARS-CoV N от мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 ( n = 3 мыши) ( g ) или SHC014-MA15 ( n = 4 мыши) ( h ). Для каждого графика значение в центре представляет среднее по группе, а столбцы ошибок определяют столбцы шкалы полусферы, 1 мм.

Чтобы оценить роль шипа SHC014 в опосредовании инфекции in vivo , мы заразили 10-недельных мышей BALB / c 10 4 блоками, образующими бляшки (pfu), либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 ( рис. 1e – h). ). Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность к 4 дню после заражения (dpi); в отличие от этого, инфекция SHC014-MA15 приводила к значительной потере веса (10%), но без летальности у мышей ( Fig. 1e ). Изучение репликации вируса выявило почти эквивалентные титры вируса в легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 ( рис. 1f ). Принимая во внимание, что легкие от мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в паренхиме легких 2 dpi ( Fig. 1g).), у мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигена дыхательных путей ( рис. 1h ); напротив, в паренхиме или в общем гистологическом балансе не наблюдалось дефицита окрашивания антигена, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-MA15 ( дополнительная таблица 2 ). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых, старых (12-месячных) животных. Животные, инфицированные SARS-MA15, быстро теряли вес и умирали от инфекции ( дополнительная рис. 3а, б ). Инфекция SHC014-MA15 вызывала устойчивую и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологии и картинах окрашивания антигенов, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных ( дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредовал инфекцию через альтернативный рецептор, на основании экспериментов с мышами Ace2 - / - , у которых не наблюдалось потери веса или окрашивания антигена после инфекции SHC014-MA15 ( дополнительная фиг. 4a, b и дополнительная). Таблица 2 ). Вместе данные указывают на то, что вирусы с шипом SHC014 способны вызывать потерю веса у мышей в контексте вирулентного остова CoV.

Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами против вируса Эбола, такой как ZMApp 10 , мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител против SARS-CoV против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на остроконечный белок SARS-CoV, и они являются вероятными реагентами для иммунотерапии 11 , 12 , 13 . Мы исследовали влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженную в процентах ингибирования вирусной репликации) и обнаружили, что тогда как SARS-CoV Urbani дикого типа был сильно нейтрализован всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител ( рис. 2a-d)), нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое с помощью фагового дисплея и избегания мутантов 11 , 12 , достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 ( Fig. 2a ). Аналогично, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из В-клеток памяти пациентов, инфицированных SARS-CoV 13 , также не смогли блокировать репликацию SHC014-MA15 ( Fig. 2b, c).). Для всех трех антител различия между аминокислотными последовательностями спайков SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатков, обнаруженным у побежавших мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230,15 L443V; 227,14 K390Q / E), что, вероятно, объясняет отсутствие антител нейтрализующая активность против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг / мл) ( рис. 2d ). Вместе результаты показывают, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь только незначительную эффективность против возникающих SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.

Фигура 2: моноклональные антитела против SARS-CoV имеют предельную эффективность против SARS-подобных CoV.

( a - d ) Нейтрализационные анализы, оценивающие эффективность (измеренную как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, которые все первоначально были созданы против эпидемии SARS-CoV, против инфекции клеток Vero SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-MA15 (зеленый). Проверенные антитела были fm6 ( n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) 11 , 12 ( a ), 230,15 ( n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) ( b ), 227,15 ( n = 3 для Урбани; n = 5 для SHC014-MA15) ( с ) и 109,8 ( n= 3 для Урбани; n = 2 для SHC014-MA15) 13 ( d ). Каждая точка данных представляет среднее значение для группы, а столбцы ошибок определяют sem. Обратите внимание, что столбцы ошибок в ячейках Vero, инфицированных SARS-CoV Urbani в b , c , перекрываются символами и не видны.

Чтобы оценить эффективность существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15, мы вакцинировали старых мышей двойной инактивированной цельной SARS-CoV (DIV). Предыдущая работа показала, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от заражения гомологичным вирусом 14 ; однако вакцина не защищала старых животных, у которых также наблюдалась патология усиленного иммунитета, что указывает на возможность нанесения вреда животным из-за вакцинации 15 . Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от заражения SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра ( дополнительная фиг. 5a, b ). В соответствии с предыдущим отчетом с другими гетерологичными группами 2b CoVs 15сыворотка от мышей, вакцинированных DIV, в возрасте мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 ( дополнительная фигура 5c ). Примечательно, что вакцинация DIV привела к сильной иммунной патологии ( дополнительная таблица 4 ) и эозинофилии ( дополнительная фиг. 5d – f ). Вместе эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от заражения SHC014 и может усиливать заболевание в возрасте вакцинированной группы.

В отличие от вакцинации мышей DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от заражения SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заразили молодых мышей 10 4 БОЕ SHC014-MA15 и наблюдали их в течение 28 дней. Затем мы заражали мышей SARS-MA15 на 29 день ( дополнительная фиг. 6a ). Предшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от заражения летальной дозой SARS-MA15, хотя был только минимальный ответ нейтрализации SARS-CoV от антисыворотки, вызванный через 28 дней после инфекции SHC014-MA15 ( Дополнительный рис. 6б1: 200). В отсутствие вторичного усиления антигена 28 dpi представляет ожидаемый пик титров антител и подразумевает, что со временем будет снижена защита от SARS-CoV 16 , 17 . Аналогичные результаты, демонстрирующие защиту от заражения летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у старых мышей BALB / c в отношении потери веса и репликации вируса ( дополнительная фиг. 6c, d ). Тем не менее, доза инфекции SHC014-MA15 10 4 БОЕ вызвала> 10% потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных ( рис. 1 и дополнительная рис. 3).). Мы обнаружили, что вакцинация более низкой дозой SHC014-MA15 (100 БОЕ) не вызывала потерю веса, но она также не защищала пожилых животных от заражения SARS-MA15 смертельной дозой ( дополнительная фиг. 6e, f ). В совокупности данные свидетельствуют о том, что заражение SHC014-MA15 может обеспечивать перекрестную защиту от SARS-CoV посредством консервативных эпитопов, но необходимая доза вызывает патогенез и исключает использование в качестве ослабленной вакцины.

Установив, что шип SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы затем синтезировали инфекционный клон SHC014-CoV во всю длину на основе подхода, использованного для SARS-CoV ( рис. 3а ) 2 . Репликация в клетках Vero не выявила дефицита для SHC014-CoV относительно дефицита для SARS-CoV ( Fig. 3b ); однако SHC014-CoV значительно ( P <0,01) ослаблялся в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 ч после заражения ( рис. 3c ). In vivo инфекция у мышей не показала значительной потери веса, но показала снижение репликации вируса в легких при полной длине инфекции SHC014-CoV по сравнению с SARS-CoV Urbani ( Fig. 3d, e). Вместе результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но позволяют предположить, что для его репликации требуется дополнительная адаптация, эквивалентная репликации эпидемического SARS-CoV в дыхательных клетках человека и у мышей.

( a ) Схема молекулярного клона SHC014-CoV, который был синтезирован в виде шести смежных кДНК (обозначенных SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E и SHC014F), фланкированных уникальными сайтами BglI, которые позволяли направленную сборку полноразмерной экспрессии кДНК открытые рамки считывания (для 1a, 1b, спайка, 3, конверт, матрица, 6–8 и нуклеокапсид). Подчеркнутые нуклеотиды представляют собой выступающие последовательности, образованные после расщепления рестриктазой. ( b , c ) Вирусная репликация SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-CoV (зеленый) после инфицирования клеток Vero ( b ) или хорошо дифференцированных первичных воздух-жидкостных интерфейсных культур клеток HAE ( c)) при МВД 0,01. Образцы собирали в отдельные моменты времени с биологическими повторностями ( n = 3) для каждой группы. Данные представляют один эксперимент для клеток Vero и HAE. ( d , e ) Потеря веса ( n = 3 для SARS-CoV MA15, n = 7 для SHC014-CoV; n = 6 для SARS-Urbani) ( d ) и репликация вируса в легких ( n = 3 для SARS-Urbani и SHC014-CoV) ( e ) 10-недельных мышей BALB / c, инфицированных 1 × 10 5 БОЕ SARS-CoV MA15 (серый), SHC014-CoV (зеленый) или SARS-CoV Urbani (черный) через в пути. Каждая точка данных представляет среднее значение группы, а столбцы ошибок определяют сем **P <0,01 и *** P <0,001 используя два хвосты Стьюдента т -теста отдельных моментов времени.

Пикабу говорит нельзя много букв писать.
По этому если интересно то можешь прочитать статью полностью здесь: https://www.nature.com/articles/nm.3985
Да я скопировал её сюда, переводил тоже не я а браузер.