Редактирование генома превратили в цепную реакцию
Ученым из Университета Калифорнии (Сан-Диего) удалось создать исключительно эффективный метод внесения мутаций сразу в две гомологичные копии генов на двух хромосомах. Он основан на системе бактериального иммунитета CRISPR/Cas9 и достигает эффективности в 97 процентов в мушек, напоминающих альбиносов. Таким образом, новый метод под названием Мутационная Цепная Реакция (MCR), позволяет конвертировать гетерозиготные мутации – в гомозиготные. Работа опубликована в Science, ей также посвящена редакционная статья журнала.
CRISPR/Cas9 – самая новая и надежная система, позволяющая редактировать геном эукариот. Она состоит из специального белка-нуклеазы (Cas9) и «кассет» РНК, которые направляют его активность на те или иные последовательности ДНК. В природе CRISPR/Cas9 выполняет роль "иммунной системы" бактерий, защищая их от вторгающихся вирусов. Если бактерии удается выжить после заражения, она «режет» вирусную ДНК и встраивает ее кусочки в собственный геном – в эти самые «кассеты» – а позже использует их как фоторобот преступника. Когда вновь попавшая в клетку ДНК вируса опознается «кассетой», тут же активируется Cas9 – белок, разрезающий чужеродную ДНК. По механизму работы эта система напоминает открытую значительно ранее РНК-интереференцию у эукариот.
Три года назад элементы системы CRISPR/Cas9 начали использовать в генной инженерии. Чтобы осуществить трансгенез, нужно синтезировать комплементарный направляющую РНК (guide-RNA) к той последовательности на хромосоме, которую требуется изменить, а также включить в конструкцию белок Cas9. При попадании в ядро РНК-проводник находит требуемую последовательность в хромосоме и точно указывает белку-нуклеазе, где ее разрезать. Затем в ДНК клетки-хозяина встраивается чужеродный ген или последовательность, нарушающая функцию данного гена (loss-of-function mutation).
В ранних версиях использования CRISPR/Cas9 удавалось внести изменения только в одну из гомологичных хромосом. В случае рецессивного наследования (то есть когда одной рабочей копии гена достаточно) такие особи хоть и несли одну мутацию, но не проявляли ее - в их геноме сохранялась нормальная, «работающая» копия гена. Чтобы получить животных с проявлением мутации ученым приходилось проводить серию скрещиваний - получать рецессивных гомозигот по мутантному гену.
Ганц и Биер создали конструкцию, которая встраивает в одну из хромосом мушки две последовательности: ген, кодирующий белок Cas9 и направляющую РНК, комплементарную второй хромосоме. Далее реакция протекает автокаталитически: со встроенной последовательности считывается конструкция-«близнец», инициирующая разрезание гена уже на соседней, гомологичной хромосоме. Клетка сама синтезирует конструкцию, разрезающую вторую хромосому в нужном месте, а затем достраивает, «ремонтирует» разрыв, внесенный белком Cas9 («ремонт» основан на природной системе исправления ошибок - гомологичной репарации, - которая существует во всех клетках). В случае с мухами вставка прерывала ген, ответственный за желтую окраску тела, в результате чего мухи, несущие мутацию на каждой из гомологичных хромосом, становились практически бесцветными.
Ученые провели ключевой эксперимент, чтобы выяснить, передается ли мутация, внесенная в женскую X-хромосому, следующим поколениям. Оказалось, что метод отлично работает и на соматических, и на половых клетках D. melanogaster: при скрещивании 97 процентов потомства было «альбиносами».
Эффективность метода уже вызвала большие опасения у некоторых ученых: такая мутация, попав на свободу, может в ураганных темпах распространяться в популяции. Гарвардский ученый Джордж Чёрч, тоже работающий с CRISPR/Cas9, считает, что подобные исследования вовсе нельзя публиковать, так как они не включают защитных мер, предотвращающих попадание мутантов за пределы лаборатории, а протокол выполнения эксперимента достаточно прост, чтобы им могли воспользоваться не только ответственные ученые.
Но именно тот факт, что отредактированные гены способны распространяться столь быстро, делает метод уникальным. Этан Биер в сотрудничестве с Энтони Джеймсом (Калифорнийский Университет в Ирвине) собирается создать мутантных москитов, гены которых будут обеспечивать устойчивость к заражению малярией и лихорадкой Денге. По подсчетам ученых, гены быстро распространятся в популяции, комары попросту не смогут заражать человека, и малярия исчезнет.
Сама работа:
http://www.sciencemag.org/content/early/2015/03/18/science.aaa5945.abstract
Статья Science:
http://www.sciencemag.org/content/347/6228/1300
CRISPR/Cas9 – самая новая и надежная система, позволяющая редактировать геном эукариот. Она состоит из специального белка-нуклеазы (Cas9) и «кассет» РНК, которые направляют его активность на те или иные последовательности ДНК. В природе CRISPR/Cas9 выполняет роль "иммунной системы" бактерий, защищая их от вторгающихся вирусов. Если бактерии удается выжить после заражения, она «режет» вирусную ДНК и встраивает ее кусочки в собственный геном – в эти самые «кассеты» – а позже использует их как фоторобот преступника. Когда вновь попавшая в клетку ДНК вируса опознается «кассетой», тут же активируется Cas9 – белок, разрезающий чужеродную ДНК. По механизму работы эта система напоминает открытую значительно ранее РНК-интереференцию у эукариот.
Три года назад элементы системы CRISPR/Cas9 начали использовать в генной инженерии. Чтобы осуществить трансгенез, нужно синтезировать комплементарный направляющую РНК (guide-RNA) к той последовательности на хромосоме, которую требуется изменить, а также включить в конструкцию белок Cas9. При попадании в ядро РНК-проводник находит требуемую последовательность в хромосоме и точно указывает белку-нуклеазе, где ее разрезать. Затем в ДНК клетки-хозяина встраивается чужеродный ген или последовательность, нарушающая функцию данного гена (loss-of-function mutation).
В ранних версиях использования CRISPR/Cas9 удавалось внести изменения только в одну из гомологичных хромосом. В случае рецессивного наследования (то есть когда одной рабочей копии гена достаточно) такие особи хоть и несли одну мутацию, но не проявляли ее - в их геноме сохранялась нормальная, «работающая» копия гена. Чтобы получить животных с проявлением мутации ученым приходилось проводить серию скрещиваний - получать рецессивных гомозигот по мутантному гену.
Ганц и Биер создали конструкцию, которая встраивает в одну из хромосом мушки две последовательности: ген, кодирующий белок Cas9 и направляющую РНК, комплементарную второй хромосоме. Далее реакция протекает автокаталитически: со встроенной последовательности считывается конструкция-«близнец», инициирующая разрезание гена уже на соседней, гомологичной хромосоме. Клетка сама синтезирует конструкцию, разрезающую вторую хромосому в нужном месте, а затем достраивает, «ремонтирует» разрыв, внесенный белком Cas9 («ремонт» основан на природной системе исправления ошибок - гомологичной репарации, - которая существует во всех клетках). В случае с мухами вставка прерывала ген, ответственный за желтую окраску тела, в результате чего мухи, несущие мутацию на каждой из гомологичных хромосом, становились практически бесцветными.
Ученые провели ключевой эксперимент, чтобы выяснить, передается ли мутация, внесенная в женскую X-хромосому, следующим поколениям. Оказалось, что метод отлично работает и на соматических, и на половых клетках D. melanogaster: при скрещивании 97 процентов потомства было «альбиносами».
Эффективность метода уже вызвала большие опасения у некоторых ученых: такая мутация, попав на свободу, может в ураганных темпах распространяться в популяции. Гарвардский ученый Джордж Чёрч, тоже работающий с CRISPR/Cas9, считает, что подобные исследования вовсе нельзя публиковать, так как они не включают защитных мер, предотвращающих попадание мутантов за пределы лаборатории, а протокол выполнения эксперимента достаточно прост, чтобы им могли воспользоваться не только ответственные ученые.
Но именно тот факт, что отредактированные гены способны распространяться столь быстро, делает метод уникальным. Этан Биер в сотрудничестве с Энтони Джеймсом (Калифорнийский Университет в Ирвине) собирается создать мутантных москитов, гены которых будут обеспечивать устойчивость к заражению малярией и лихорадкой Денге. По подсчетам ученых, гены быстро распространятся в популяции, комары попросту не смогут заражать человека, и малярия исчезнет.
Сама работа:
http://www.sciencemag.org/content/early/2015/03/18/science.aaa5945.abstract
Статья Science:
http://www.sciencemag.org/content/347/6228/1300