Ядерный магнитный резонанс, ЯМР⁠⁠

Приветствую!

Когда я только начинал пилить посты на Пикабу, я решил, что не буду заниматься научпопом. Весь научпоп, который я читал\слушал\смотрел до этого, был либо не научным, либо не популярным.

Однако по мере написания постов серии "Сколько стоит лабу построить" мне волей-неволей пришлось ступить на эту скользкую дорожку, просто для того, чтобы читатели понимали, зачем мы покупаем очередную страхолюдную хреновину ценой в крыло от истребителя. В процессе же подготовки текста очередной части, дойдя до ЯМР-спектрометра, я понял, что рассказать о нём в двух словах просто-таки невозможно, такую большую роль он играет в работе органика-синтетика. Поэтому я выделяю рассказ о нём в отдельный пост, чтобы потом просто сослаться на него при перечислении.

Итак, поехали!

Для начала немного техноэротики. 900 МГц ЯМР фирмы Varian. Для понимания масштаба на прибор сверху поставлена девушка =)

Итак, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, или ЯМР. Только за сам метод и его развитие было присуждено две Нобелевские премии - по физике за 1952 год и по химии за 1991 год. Плюсом к этому идут ещё две премии - химия за 2002 год, за филигранное использование метода для определения структуры биомолекул, и по физиологии и медицине за 2003 год - за МРТ. Сколько работ, получивших Нобелевскую премию, стали возможными благодаря ЯМР - не счесть!

Метод ЯМР не имеет конкурентов в деле установления структуры растворимых молекул. Даже рентгеновская дифракция на монокристаллах обладает куда более скромными возможностями - для неё нужен монокристалл, тогда как ЯМР работает с любыми растворами. Кроме того, ЯМР позволяет анализировать смеси, и даже дает информацию об их составе. Остальные же методы, будь то спектроскопия или что-то другое, безнадежно проигрывают ЯМР в этой области. Вдобавок, метод ЯМР можно использовать для изучения механизмов, кинетики и термодинамики реакций, для конформационного анализа, физико-химических экспериментов таких как измерение коэффициентов диффузии. Большинство журналов, посвященных органической химии, считают ЯМР самым надежным методом установления структуры и чистоты вещества.

В основе метода лежит тот факт, что многие атомные ядра обладают ненулевым собственным магнитным моментом μ. Магнитный момент, как и любой момент - величина векторная, тобишь имеет направление. Вектор μ может иметь несколько направлений, каждое из которых характеризуется проекцией на условную ось вращения ядра, и соответствующие им значения ядерного спина m. Значения эти равны косинусу угла между вектором μ и условной осью вращения. В сферическом ядре в вакууме эти направления вырождены, т.е. соответствующие им состояния неразличимы. Однако если мы наведем внешнее магнитное поле, то мы получим точку отсчета - вектор индукции, и вырождение снимется - мы сможем различать между собой состояния m. Далее для простоты изложения и восприятия я в качестве примера буду использовать протон - ядро 1Н, имеющее m = (+/-)1/2.

Энергетическая диаграмма спиновых состояний ядра 1Н. Как можно заметить, величина ΔE прямо пропорциональна B0.

Если есть два состояния, отличающихся по энергии - система может переходить между этими состояниями. Разумеется, не бесплатно - для того, чтобы попасть на более высокий уровень, система должна откуда-то взять энергию, а чтобы попасть на более низкий - кому-то эту энергию отдать. В том случае, когда эта энергия поглощается/излучается в виде электромагнитной волны, говорят о резонансном поглощении/испускании. При температурах записи ЯМР-спектров (редко превышающих 500 К) почти все ядра находятся в основном, самом низкоэнергетическом, состоянии. Доля возбужденных ядер крайне мала.

Энергия, а, следовательно, длина волны, соответствующая резонансному переходу в ЯМР, прямо пропорциональна величине индукции поля, и связана с ним посредством гиромагнитного отношения γ, которое является постоянной величиной для каждого ядра. Однако, говоря о ЯМР, принято оперировать не длинами волн, а частотами, благо они связаны друг с другом соотношением Планка. В итоге имеет место быть следующее соотношение между резонансной частотой поглощения/испускания:

ν = γB0/2π

Для ядер 1Н резонансная частота при индукции поля в 11.74 Тл составляет 500 МГц. Это довольно-таки типичные параметры для современного ЯМР-спектрометра.

Изначально спектры снимали очень просто - банально сканировали интересующий диапазон частот, записывая спектр поглощения (то есть зависимость доли поглощенной энергии от частоты). Были спектрометры, в которых меняли частоту при постоянном поле, потом перешли к более простой схеме - менять поле при постоянной наблюдаемой частоте. Однако оба этих варианта были далеки от идеала. Были проблемы и с чувствительностью, и с качеством спектров, и с временем съемки, и с количественными характеристиками спектра. Были даже проблемы, связанные с нагревом образца из-за постоянного облучения!

И тогда на помощь пришел Шарль Фурье, а точнее, его преобразования, позволяющие разложить сумму гармонических колебаний на спектр - совокупность частот и соответствующих им интенсивностей. Фурье-ЯМР выглядит так: сначала образец облучают коротким высокочастотным импульсом, покрывающим весь интересующий диапазон. Этот импульс частично поглощается ядрами, создавая определенную заселенность возбужденного уровня. А дальше возбужденные ядра начинают релаксировать - испускать излучение в радиочастотном диапазоне, переходя обратно в основное состояние. Записывая совокупный электромагнитный сигнал как функцию от времени, получают так называемый спад свободной индукции.

Схема ЯМР спектрометра. Жидкий азот и гелий нужны для работы сверхпроводящего магнита.

Вся электроника, содержащаяся в корпусе магнита, находится в самом низу прибора. А образец загружают через верх. На ампулу надевают специальную турбинку, и вставляют всё это в трубку сверху. Ампула поддерживается потоком воздуха. После нажатия на кнопку она опускается вниз, и благодаря турбинке, раскручивается сжатым воздухом (любые механические привода в этой зоне будут давать помехи). После окончания эксперимента образец поднимается наверх тем же сжатым воздухом. Помимо ручной загрузки образцов используют автосамплеры.

Современные ЯМР-спектрометры исследовательского класса создают в рабочей зоне поля в 10 Тл и выше, причем очень низкоградиентное в значительном объеме. Единственный способ обеспечить такое поле - использовать сверхпроводящий магнит. А это выливается в необходимость непрерывного обеспечения спектрометра жидким азотом и жидким гелием. И если небольшой генератор жидкого азота стоит, по сравнению с самим спектрометром, сущие гроши - 3-5 млн.р., то с жидким гелием могут возникнуть проблемы. Если провафлить заливку азота или гелия (азот нужен чтобы дорогой гелий медленнее испарялся) - прибор вырубается и попадаешь минимум на 100К. Столько стоит его повторный запуск. А может и поломаться, там суммы вообще труднопрогнозируемые.

Помимо сверхпроводящего магнита в самом корпусе магнита находятся излучатели и приемники радиочастотного диапазона, а также всякие вспомогательные приблуды - нагреватели\охладители, специальный пневматический привод для вращения образца и т.д. Кроме корпуса магнита есть ещё т.н. радиоблок - тумба, в которой находятся импульсные генераторы, детекторы и прочая электроника. Подключено это всё, естественно, к компьютеру, который после определенных манипуляций выдает FID.

Вот так выглядит FID - спад свободной индукции. По оси абсцисс - время, по оси ординат - интенсивность излучения.

Пропустив эту функцию через жернова преобразований Фурье мы получаем ЯМР-спектр в привычном нам виде, то есть в виде зависимости интенсивности от частоты.

Вот один из реальных спектров, который я снимал N лет назад. Так он выглядит после всей обработки, так он и был вставлен в статью.

Возникает логичный вопрос - а как всё это связано со строением молекулы? Дело в том, что в молекуле есть и другие частицы, имеющие магнитный момент - электроны. Электроны образуют в пространстве, занимаемом молекулой, неодородное магнитное поле, которое может слегка (на миллионные доли) изменять величину индукции магнитного поля в той или иной точке. А вместе с изменением поля меняется и резонансная частота. В итоге выходит, что резонансная частота того или иного ядра зависит от электронной плотности вокруг него. Ну а электронная плотность отражает строение молекулы.

Но этой информации явно маловато. Благо, из ЯМР-спектра на ядрах 1Н можно выжать ещё немало информации. Начнем с того, что в силу нашего сказочного везения ядра 1Н позволяют без особых ухищрений записывать спектры, отражающие количественную картину. То есть, интегральные интенсивности сигналов в спектре пропорциональны количеству резонирующих протонов. Скажем, в 1Н ЯМР спектре пропана, который содержит 6 эквивалентных метильных протонов и 2 эквивалетных метиленовых протона, мы увидим 2 сигнала с соотношением интенсивностей 6:2. Большинство остальных ядер не позволяет без танцев с бубном оценивать количество эквивалентных ядер, но и протонов хватает.

Кроме того, ядра, расположенные близко друг к другу, могут взаимодействовать друг с другом. Взаимодействие это, называемое спин-спиновым, передается по химическим связям, поэтому близость определяется числом связей, разделяющих ядра, а не кратчайшим расстоянием. Взаимодействуя, ядра образуют спиново-связанный ансамбль, который дает сигналы сложной формы, состоящие из нескольких пиков разной интенсивности. Анализируя формы этих сигналов, можно получать информацию о взаимном расположении ядер в молекуле.

Я не буду углубляться в специальные импульсные последовательности и тем более в 2D-ЯМР спектроскопию. Эти техники позволяют выжать из ЯМР-спектров молекулы ещё массу структурной информации, но их слишком много и они слишком сложны. Скажу только, что на сегодняшний день практически не осталось задач установления структуры органических веществ, которые бы не были разрешимы с помощью спектроскопии ЯМР.

Теперь о практической стороне вопроса. Для органиков ЯМР = жидкостный ЯМР, где образец анализируется в виде раствора в дейтерированном растворителе. Дейтерированный он должен быть, во-первых, чтобы протоны растворителя не подавляли сигналы растворенного вещества, а во-вторых, чтобы осуществлять дейтериевую коррекцию, позволяющую избежать уширения, связанного с дрейфом поля. Раствор должен быть гомогенным (никакой взвеси\пыли\эмульсии) и не содержать парамагнитных примесей. Раствор образца помещается в ЯМР-ампулу стандартного образца, изготовленную из специального стекла.

5 мм ЯМР-ампулы с крышками. Есть ещё 3 мм и, вроде, 7 мм. Чем более однороден и диамагнитен материал стекла, тем выше качество спектров.

Теперь о ценах. Цена спектрометра в первую очередь определяется его рабочей частотой (в разговорах всегда оперируют рабочей частотой на ядрах 1Н). Для 400 МГц приборов, оптимальных для рутинных задач, эта цена составляет около 15-20 млн. р. (очень приблизительно, я сам их никогда не покупал). Плюс, нормально оборудовать помещение под ЯМР стоит около 1 млн.р. Если разделить эту ношу, условно говоря, на 50 пользователей, выходит 300-400К на человека. Но эти приборы редко покупают за свои, обычно деньги на ЯМРы выделяет учреждение. Реже, но бывает, когда прибор покупает несколько групп, вскладчину. Правда, тогда пытаются найти БУ прибор подешевле. Кроме того, в прибор надо постоянно доливать охладители. Я боюсь соврать, но слышал, что за год один ЯМР на 400 МГц сжирает жидкого азота и гелия на 300-400К. Гелий стоит в районе 1К за литр (sic!), так что цифры реалистичные.

У нас стоит несколько приборов с частотами от 300 до 600 МГц. Кроме обычных, жидкостных ЯМРов есть твердотельный ЯМР, который работает не с растворами, а с твердыми образцами, и ЯКР-спектрометр, который вообще дичь творит. Число снятых за последние 5 лет спектров только на жидкостном ЯМР - около 150 000.

А вот так выглядит 500 МГц прибор, используемый для измерений чуть сложнее рутинных. Справа - магнит, слева - радиоблок. В этот прибор высокий человек ещё может засунуть образец без стремянки, но обычно к ним всё-таки ставят хотя бы приступку.

Далее расходка. ЯМР-ампулы стоят очень по-разному. Для рутины мы пользуемся бюджетными, которые с крышкой стоят около 100р\штука. На одного синтетика надо иметь хотя бы 50 шт или 5К. И наконец самое интересное - дейтерированные растворители. На один спектр нужно 0.5 мл растворителя. Активно работающий на ниве органического синтеза химик за год снимает ЯМР спектры около 500 образцов. Это 250 мл растворителей. Примерные цены на растворители:

D2O  2 руб\мл

CDCl3  30 руб\мл

ацетон-d6  120 руб\мл

ДМСО-d6  150 руб\мл

C6D6  200 руб\мл

MeCN-d3  200 руб\мл

ДМФ-d7  2000 руб\мл

Органика редко растворяется в воде, поэтому отскочить на D2O вряд ли получится. Есть люди, которые 99% спектров снимают или в CDCl3, или в смесях CCl4 или CS2 с 10% добавкой C6D6 или ацетона. В этом случае можно обойтись 7-10К в год. В среднем же расход на человека выходит около 20К в год.

Итого, если считать на 4 человека, на расходку выходит 100К в год. Вроде немного, но научная группа из 12 взрослых сотрудников (вполне средняя цифра) сжирает 300К каждый год! Это эквивалентно роторному испарителю, причем даже не в минималке.

А вот как выглядит бенчтоп-ЯМР на 80 МГц. Для понимания масштаба рядом инсулиновый шприц и стакан на 100 мл.

Кстати, в последнее время появилось много настольных ЯМР-спектрометров вроде того, что на картинке выше. Рабочая частота таких приборов - от 40 до 90 МГц, на постоянных магнитах без всякого жидкого гелия. По меркам современных исследовательских приборов это несерьезно, но продвинутая электроника и алгоритмы постобработки позволяют получать спектры на уровне старых 200 МГц-спектрометров, что достаточно для большинства рутинных спектров.

Помимо отсутствия жидкого гелия есть и ещё бонусы - малый объем пробы, возможность съемки без дейтерорастворителя, и, самое главное - возможность вводить образцы обычным шприцом или подключать прибор к жидкостному хроматографу. Стоит такая машинка 2-5 млн. р. Честно говоря, работать на таком пока не доводилось, но очень хочется.

Сегодня я попытался рассказать, что это за зверь - ядерный магнитный резонанс, и почему этот метод востребован и любим всеми органиками-синтетиками. Мой отпуск скоро заканчивается, и посты будут выходит намного реже. Но всё-таки я постараюсь добить хотя бы серию "Сколько стоит лабу построить" в разумные сроки.

На сегодня всё!

Баянометр выдаёт какую-то фигню. Комменты для минусов внизу.