Можно ли генномодифицировать собственные клетки?
Для ЛЛ: Можно!
Внимание: Не рекомендуется повторять описанные в статье действия.
Стрелки указывают на колонии трансдуцированных (заражённым врусом) клеток в моём теле.
Я создал этот пост как демонстрацию, насколько на самом деле просто и сравнительно безопасно можно синтезировать вирусные векторы и внедрять синтетические гены в человеческие клетки. Примерно похожим способом создавалась вектораня вакцина Спутник-5. Вектор это синтетическая ДНК, которая соддержит ряд генов которая система лентиврусной доставки встроит в код ДНК целевой клетки.
В данном случае мы используем вектор pLenti-EF1a-C-mGFP-P2A-Puro из интересных генов на векторе mGFP синтетически зелёный флоуресцентный протеин основанный на сиквенсе оригинального GFP из генома медузы Aequorea Victoria обеспечивает яркую флоуресценцию в синем (488 нм) свете. Длинная гена GFP 720 нуклеотидных последовательностей общий размер вектора 8300 нуклеотидов.
Так же на векторе есть ген устойчивость к пиромицину (клетки соддержащие этот ген не погибнут при воздействии пиромицина) всё это под промотером EF1a который обеспечивает постоянное производство mGFP и остальных генов. Вот карта вектора в подробностях. Обратите внимания на участкок помеченный SgfI Asc I и Rsr II, MluI и Not I по сути этот вектор заготовка, если в этот участок врезать (с помощью ферментов рестриктаз) код того или иного протеина трансдуцированные клетки будут его производить а GFP всего лишь маркер доставки. Если клетки светятся зелёным значит трансдукция произошла успешно. Если бы я вставил в вектор сиквенс S-протеина COVID-19 у меня бы получилась вакцина к COVID-19 собственного производства. Таким же образом можно лечить заболевания когда утрачена та или иная функция генов.
Медуза Aequorea Victoria свечение медузы обеспечивает Аквеорин который продуцирует синее свечение в присутствии ионов калция. GFP поглощает этот свет и излучает уже зелёное свечение. Аквеорин используется в исследовательской работе для оценки количестве калция в клетках. За расшифровку генетической последовательности GFP 2008 году Осаму Симомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсьен получили Нобелевскую премию по химии «за открытие и разработку зелёного флуоресцентного белка GFP».
Всё это упаковывается в лентивирусную оболочку с помощью двух дополнительных плазмид PAX2 и VSV-G фомируя вирусные частицы и собирается воедино на клетках HEK293T это наш инкубатор для сборки вируса. Клетки HEK293 широко используются для производства вирусов и протеинов. Противники вакцин часто упоминают HEK293 как материал нерождённого мальчика. Да, действительно HEK293 были получены из абортивного материала, можете подробнее про них почитать тут: https://ru.wikipedia.org/wiki/HEK_293
Клетки HEK293T 80% конфлюентности, готовый материал для сборки вируса.
После того как HEK293T произвели вирус, достаточно его отфильтровать из кульутры, используя 0.22 мкм фильтр он остеет клетки и клеточные фрагменты. У меня получилось что-то в духе 3 миллиардов вирусных частиц на миллитр объема. Теперь давайте посмотрим как оно работает. Помните любая заражённая клетка будет светится в синем свете. Можно было конечно заразить клеточную культуру и посмотреть на неё под микроскопом. Как видите, эффективность трансдукции около 30% тут как раз может пригодится ген устойчивости к пиромицину если добавить пиромицин в культуру не трансдуцированные клетки погибнут и получится чистая культура трансдуцированных клеток, этот процесс называется селекция.
Но заражать клеточные культуры это настолько банально, что я решил заразить вирусом самого себя и просто набил 23G иглой слово Pikabu у себя на запястье, обмакивая иглу в ампулу с вирусом. Очень приблизительно каждый укол доставлял 3-5 миллионов вирусных частиц. Это совсем не опасно, на самом деле что-то такое (заражение клеток вашей кожи различными вирусами) происходит ежедневно вы просто этого не замечаете. Разумеется не было ни температуры ни каких либо симптомов. Хорошо, что я как следует отфильтровал и для надёжности заморозил и разморозил вирусную культуру, идея ввести себе хотя бы несколько жизнеспособных HEK293T клеток более чем пугающая, теоретически моя имунная система может с ними справится, но это очень агрессивные и быстростущие онкологические клетки, у меня нет ни малейшего желения это проверять.
Спустя несколько дней, я решил посмотреть получилась ли у меня генно-модифицировать свои клетки. Тут я столкнулся с рядом проблем. Моё оборудование расчитанно на микроскопические объекты, но как при этом подсветить собственную руку светом 488 нм и при этом сделать фотографию? Решение было следующим, источником света был всё тот же микроскоп для экситации GFP светом 488 нм, но если просто сделать фотографию таким образом, ничего не будет видно из за отражения синего света в камеру телефона. Поэтому я добавил фильтр перед камерой телефона который блокировал значительную часть синего света, фильтр далеко не идеальный и несколько сбил цветовую гамму. Качество снимка получилось так себе, но видите эти яркие точки, это как раз свечение GFP в местах уколов где сформировались колонии заражённых лентивирусом клеток! Теперь у меня на руке есть скрытое слово Pikabu которое можно увидеть только в ярком синем свете за счёт внедрения генов медузы. Оставаться оно там будет достаточно долго, однако глобального позеленения можно не опасаться, лентивирус не имеет кода репликации, так что размер светящихся точек примено соотвествует количеству вирусных частиц доставленных в уколе иголкой. Разумеется можно добиться ещё более яркого свечения, если сделать иньекцию значительно большего количества лентивирусных частиц. Если бы авторы вакцины Спутник 5 решили прикрутить GFP к вакцине, то в месте укола бы появилось яркое пятно которое бы светилось в синем свете.
Подводя некий итог, лентивирусы работают в человеческом организме так же эффективно как и в клеточной культуре. Их производство вполне отработанный и не сложный процесс, если имеются хотя бы базовые инструменты и знания моллекулярной биологии. Однако даже если у вас есть необходимые условия для производства аденовируса или лентивируса не стоит повторять этот эксперимент, нужно очень хорошо понимать, что и как вы делаете. Надеюсь теперь вы лучше понимаете принципы создания и применения вирусных векторов в медицине для создания вакцин и лечения генетических заболеваний.