Жду новый пост

Серия «Научные исследования и популяризация науки»

Обычно с такими заголовками люди рассказывают о своей болезни и как им удалось её преодолеть, но это несколько другая история. Учёному редко удаётся повлиять на глобальные события в мире. Как правило, исследовательская деятельность заканчивается на публикации результатов в научном журнале, иногда престижном, иногда не очень. На неё ссылаются другие статьи других учёных и всё это вместе на неощутимые микрометры двигает познание человечества о мире вперёд. Эксперименты, статьи в журналах, индексы цитирования, гранты, отчёты, вот в общем то и всё. Но иногда, очень редко, одно открытие действительно меняет всё. Десятилетия люди думали о синтетической роговице. Казалось бы, роговица — это же всего лишь коллагеновая линза, в ней нет сосудов. Наши технологии разработки гидрогелей и биоматериалов значительно продвинулись за последние десятилетия. Может можно создать нечто наподобие контактной линзы, которую можно просто пришить человеку вместо больной роговицы, и он будет видеть? Собственно, именно это в конечном счёте мы и сделали, только потребовалось 10 лет, десятки тысяч, человеко-часов работы, жизни сотен крыс, кроликов и свиней чтобы получить рабочую сборку, но обо всё по порядку.

Кератоконус – это патология роговицы, где коллагеновые волокна теряют свою устойчивость, центральная часть выпячивается наподобие конуса, отсюда и название. Роговица перестаёт выполнять свои оптические свойства формируя размытое изображение на сетчатке. На начальных этапах этот процесс поддаётся коррекции очками и контактными линзами, но со временем оптических возможностей стекла становится недостаточно. Почти все системы глаза функционируют нормально, но человек больше не видит предметов и может лишь отличить день от ночи. В терминальной стадии коллапс коллагеновых волокон становится катастрофическим, роговица больше не может контролировать водный баланс, набухает и становится окончательно непрозрачной. Встречается кератоконус у одного человек из 700, этакая лотерея правда главный приз так себе. Кератоконусом страдают около 10 миллионов пациентов в мире, если собрать их в одном месте, получится город Москва или Сан-Пауло, полностью из слепых и слабовидящих людей. К сожалению, большинство пациентов с кератоконусом теряют зрение гораздо раньше, чем болезнь переходит в тяжёлую стадию, так как жёсткие контактные линзы доставляют слишком большой дискомфорт при ношении, а мягкие контактные линзы на кератоконусе не держатся из-за аномальной топографии глаза. Представьте себе дилемму, терпеть чудовищную боль в глазах, но хоть что-то видеть или смириться с жизнью в мире размытых теней. Со временем почти каждый пациент выбирает второе, слишком тяжело носить жесткие линзы.

Топография роговицы и острота зрения у здорового глаза и при кератоконусе. Красным помечается истончение роговицы в центральной зоне. Внизу симуляция астигматизма при кератоконусе.

На самом деле не так много вариантов лечения кератоконуса.

1. Крослинкинг с витамином B2 ультрафиолетовым светом – Витамин B2, он же рибофлавин очень интересное вещество, под воздействием мягкого ультрафиолета-А он может связываться с коллагеновыми волокнами увеличивая их прочность. После крослинкинга роговица укрепляется и процесс замедляется, но полностью остановить кератоконус таким образом нельзя.

2. Трансплантация роговицы – больную роговицу можно просто заменить, здоровая роговица будет иметь правильную форму и человек снова сможет видеть. Роговица наиболее успешно трансплантируемый орган. Казалось бы, почему вообще есть слепые люди с кератоконусом в таком случае? Пересадка роговицы требует развитой системы глазных банков, где процесс забора донорских глаз, тестирования гепатитов, ВИЧ и рядя других патогенов и немедленной пересадки отработан. Все это выливается в высокую стоимость процедуры и ограниченную доступность роговиц. К тому же они очень нужны для ряда других тяжёлых заболеваний как ожоги роговицы, дистрофия Фукса и многие другие заболевания требущих пересадки.

Иллюстрация процедуры кросслинкинга из материалов статьи Cross-linking of protein scaffolds for therapeutic applications: PCL nanofibers delivering riboflavin for protein cross-linking 10.1039/C3TB21789B

Виды пересадки роговицы PKP - Penetrating Keratoplasty, пересадка роговицы на всю толщину. И DALK - Deep Anterior Lamellar Keratoplasty частичная пересадка стромы роговицы с использованием лазера. Процедура DALK предпочтительней она сохраняет эндотелиальный фрагмент для ещё одной пересадки пациенту с дистрофией Фукса (если такой есть в наличии), так же процедура менее травматична, сохраняется оригинальный эндотелий и эпителий.

Синтетическая роговица должна обладать следующими свойствами.

1. Обладать высокими оптическими свойствами.
2. Не пропускать ультрафиолет, нейроны сетчатки очень его не любят, но хорошо пропускать видимый спектр.
3. Быть достаточно жёсткой для хирургического вмешательства, тончайшие полипропиленовые нити, которые используются в офтальмохирургии не должны её резать, но имплант не должен быть слишком жёстким чтобы не причинять дискомфорт и не получить отторжение. Кусок пластмассы пересадить не получится.
4. Материал должен быть совместим с клетками человеческого тела, он должен интегрироваться в живые ткани, при этом обладать достаточно жёсткой структурой, чтобы макрофаги не растащили его на сувениры.
5. По возможности синтетическая роговица должна быть сделана из дешёвого материала и подходить для массового производства и стерилизации.
6. Полученный продукт должен иметь возможность длительного хранения в том числе и при комнатной температуре.

Славный город Линкопинг.

Как видите в требованиях к материалу аналогу роговицы - сплошные противоречия. В 2015 году меня пригласили в Швецию попытаться решить эту не решаемую задачу. Деньги на это предоставляла компания LinkCare и несколько европейских грантов в том числе Европейским Arrest Blindness. Я слетал в Москву, получил Шведский вид на жительство, и полетел в славный город Ликопинг. Говорят, в Швеции довольно красиво, если честно, я страну так толком и не посмотрел, был в Стокгольме по делам несколько раз, не более того. По большей части следующие 2 года я практически не выходил из лаборатории, приспособился даже спать в офисе, да и вся наша научная команда практически жила там. Пять часов сна, кофе, таблетка кофеина чтобы разогреться с утра, сигарета или даже три и можно начинать. Как сказал классик "Распалась связь времён" день и ночь, дни, месяцы и годы слились в один размытый процесс, мир за пределами лаборатории стал казаться нереальным. Думаю мы вели не самый здоровый образ жизни.

Будни лаборатории, в кадре Мария Ксерорудаки за микроскопом, Энтони Муквая и ваш покорный слуга Доктор Ганнибал обсуждают эксперимент по очередной тестовой сборке на заднем плане.

Каждый в команде отвечал за выполнение одного или нескольких аспектов проекта. Я, в частности, тестировал сборки материала на крысах и кроликах и анализировал стабильность материала гистологическими исследованиями. Многие научные группы раньше пытались использовать разные материалы от гидрогелей, пластиков, до синтетического человеческого коллагена. Результаты в большинстве случаев получались чудовищные. Отторжение, распад материала, острый воспалительный процесс, потеря оптических свойств. Много несчастных кроликов с вытекшими глазами, очень недовольные сотрудники вивария.  После нескольких неудач мы сфокусировались на коллагене тип I (Collagen I), полученном из кожи свиней, он был дешёвым, линзы из него получались с отличными оптическими свойствами. Коллаген тип 1 и не вызывал отторжения, но не все гладко было с прочностью, пропусканием ультрафиолета и долговременной стабильностью мы называли материал BPC (Bioengineered Porcine Construct). Кролики получали роговицы, они около трех месяцев они функционировали нормально, дальше иммунная система начинала разбирать пересаженный материал, коллапс трансплантата и очередная неудача. Нужно было перерабатывать дизайн, возможно использовать другой коллаген, но мы уже были близко. Тогда мы вспомнили о крослинкинге с витамином B2, если крослинкинг у людей укрепляет роговицу, может он сможет помочь укрепить и биоматериал. Так же B2 поглощает ультрафиолет, и мы сможем решить проблему пропускания ультрафиолета синтетической роговицей.

Доктор Мутукумар Тангевелу до начала проекта и после его завершения.

Мой коллега Мутукумар заработал нервное и физическое истощение, но нашёл сборку, которая отвечала нужным свойствами. Особая программа двойного ультрафиолетового крослинкинга с витамином B2 и дальнейшая стерилизация ультрафиолетом-С. В электронном микроскопе материал выглядел очень хорошо, похоже на настоящую роговицу. Главное, поместив материл в спектрофотометр, мы увидели, что поглощение ультрафиолета в целом совпадает с человеческой роговицей B2 выполнил свою задачу. Механические свойства и устойчивость на разрыв тоже вырасли. Клетки роговичного эпителия человека росли на новом материале отлично, гораздо лучше, чем обычном пластике в культуре.

а. Внешний вид биоматериала BPCDX. b. Спектрофотометрия BPCDX в УФ и видимом спектре. с. Механические свойства биоматериала, он получился в три раза менее прочным чем человеческая роговица, но этого хватило. d. снимки структуры волокон свинной роговицы и сборки BPCDX биоматериала. e. Скорость разрушения биоматериала протеолитическими ферментами в сравнении с человеческой роговицей. f. Рост клеток роговичного эпителия человека на пластике (слева) и на BPCDX (справа).

Я подсадил материал крысам подкожно, посмотреть, как будет идти заживление ран и как материал себя поведёт в живом теле. Раны у крыс заживали хорошо, а главное, когда я извлёк материал месяц спустя не было ни воспаления, ни клеточной инфильтрации вокруг импланта. Совсем чуть чуть фиброза на границе с имплантом, но материал иплантировался подкожно на не в глаза, это было ожидаемо.

Почему в данном случае тело реципиента не отторгает имплант?

Потому что очищенный коллаген 1 малоиммуногенен, имунная система на него мало реагирует, коллагены вообще очень древние протеины например у динозавров коллаген 2 такой же как страусов Первое обнаружение протеинов и ДНК динозавров

Так что коллаген 1 у свиней и людей практически идентичен. Кроме того, мы его дополнительно прошили рибофлавином, так что имунной системе ещё труднее распознать, что там вообще что-то есть. Распознать вмысле сожрать кусок считать аминокислотный код и притащить его Б клеткам, для производства антител, антитела к коллагену 1 в норме не производятся иначе они вас убьют или как минимум вызовут тяжёлое аутоимунное заболевание. К тому же кусок коллагена получился большим и монолитным не откусишь к тому же очень незаметным, на срезах из подкожной имплантации крыс видно что очень мало клеток тусутеся вокруг импланта. Ранняя версия BPC была мягкой слишком мало рибофлавина, имунная система на него не реагировала, но имунные клетки его потихоньку жрали, они так шрамы рассасывают например, шрамы то тоже из коллагена.

Теперь нужно было посмотреть, как материал поведёт себя в глазах, мы купили 10 мини свиней  и принялись за работу. 

Схема хирургической процедуры DALK-Flap у свиней. Фемтосекундным лазером, свиньям делался вырез роговицы в виде кармана, фрагмент роговицы удалялся и в этот карман мы помещали биоматериал. В качестве контроля мы использовали вырезанные фрагменты оригинальной роговицы и подсаживали их обратно, это называется аутотрансплантация.

Свиньи пожалуй лучшее животное для экспериментов на глазах, но большое, дорогое и шумное.

Дальше было очень много возни со свиньями они ведь только мини по сравнению с обычными, 30 килограммовые зверюги которым нужно было капать дексаметазоновые капли в глаза после операции, под дикие визги в экспериментальном хлеву.

а. Результаты оптической когерентной томографии и фотографии глаз 6 месяцев после пересадки. b. Пахиметрия (топография) роговицы после пересадки роговицы или материала BPCDX. c. Параметры тощины роговицы и частота осложенений после пересадки у мини-свиней. d. Конфокальная микроскопия слоев роговицы с автографтом или BPCDX.

Полгода спустя эксперимент подошёл к концу, к нашему восторгу биоматериал, который мы к тому времени назвали BPCDX (bioengineered porcine construct, double crosslinked) полностью интегрировался, даже лучше, чем при авто-трансплантате, родной кусок роговицы, который мы вырезали и сразу пересадили обратно для контрольной группы. Топография роговицы выровнялась, а самое главное вкруг биоматериала стали расти роговичные нервы и никакого воспаления или помутнения.

Интеграция биоматериала в окружающие ткани роговицы по результатам гематоксилин эозинового окрашивания. Бета-3-Тюбулин показывает рост нервов вокруг импланта.

Настало, временя испытать процедуру и биоматериал на слепых людях с кератоконусом. Это был очень длительный с точки официальных документов и очень напряжённый этап. Если мы где-то допустили ошибку, например, в том, что свиной коллаген хорошо приживался у свиней, но у людей может вызывать иммунный ответ, а протестировать снова уже не было времени и денег. Если я ошибся, десятки людей испытают чудовищные страдания и возможно потеряют то немногое, что них осталось от их глаз. Уверен ли я в своих результатах? Когда я подписывал документ “Свойства биосовместимости допустимы для человеческого применения”, я на самом деле вовсе не испытывал той уверенности, что показывал комиссии во время презентации.

Тестировать биоматериал мы решили на группе добровольцев из Ирана и Индии. Во-первых, из финансовых соображений, это было дешевле ресурсы выделенные на проект стали подходить к концу, во-вторых, в этих двух странах было достаточно полностью слепых пациентов с кератоконусом, и хирурги в двух центрах согласились участвовать в проекте. Мы немного беспокоились, что пациенты в Иране могут отказаться от трансплантации по религиозным соображениям, всё-таки биоматериал был сделан из свиного коллагена, но, проблем с этим не возникло, никто даже не задал о свином коллагене вопрос, наверное, когда ты едва можешь отличить день от ночи границы допустимого, сильно раздвигаются.

Внешний вид тестового продукта для клинических испытаний. Тестовая сборка BPCDX до начала массового производтсва. Кроме собственно кератоконуса BPCDX может быть использован как замена человеческой роговицы при множестве других патологий требующих пересадки.

Основные критерии для отбора для участия в клинических испытаний были следующие:

-Возраст совершеннолетия.
-Выраженный кератоконус
-Показания к пересадке роговицы.
-Способность понять объяснения и подписать официальные документы для участия.
-Отсутствие операций на глаза
-Отсутствие системных заболеваний

Операции прошли штатно, они сравнительно простые и мы давно всё отработали на свиньях. С каждой неделей я с ужасом ждал звонка или электронного письма, что импланты начали отторгаться. Мне снились выворачивающие душу кошмары в котором я был окружён людьми с вытекшими глазами они цепко хватали меня за руки и кричали на непонятном языке, но я понимал - "Это ты виноват!", с кофеином в таблетках нужно было завязывать. Но эти переживания были у меня в голове, в реальности, сразу после операции люди смогли видеть. Пусть им всё равно потребовались очки или контактные линзы, но они по крайней мере могли их теперь носить. В больницу привели 20 практически слепых людей, вышли уже зрячие пусть и на один глаз. Из соображений безопасности пациентов мы делали трансплантацию только на одном глазу. К 6 месяцам я наконец выдохнул, похоже трансплантаты были стабильны, оставалось только ждать. Дольше 6 месяцев мы на животных эксперименты не проводили и меня несколько беспокоил тот факт, что мы не знали как долго рибофлавин который держал коллагеновые волокна остаётся стабильным тем более в человеческом теле, проект шёл через неизведанные воды. Узнать, что происходит с пациентами больше не представлялось возможным, повторный осмотр была запланирован только через 1.5 года, так что отсутствие новостей было само по себе хорошей новостью.

Схема операции при испытании BPCDX у людей.

К концу первого года после пересадки я стал забывать о пациентах и проекте в целом сместив свои интересы в сторону нейробиологии, дегенерации сетчатки и болезни Альцгеймера. Наконец 24 месяца после пересадки пациенты вернулись в клинику, пришли своим ходом и без сопровождающих, большинство пациентов жили полноценной жизнью, смогли найти работу, многие просили нас провести пересадку на второй глаз, к сожалению, программа исследования этого не подразумевала и бюжет проекта был истощён. Результаты были отличными, BPCDX интегрировался в окружающие такни, роговичные нервы регенерировали эпителий и эндотелий роговицы функционировали штатно, а главное никакой резорбции и отторжения импланта.

Пахиметрия и оптическая когерентная томография у пациентов в Иране до и после хирургического вмешательства. В нижнем левом углу фотографии BPCDX в глазах у двух пациентов 6 месяцев после хирургического вмешательства. В нижнем правом углу результаты конфокальной микроскопии роговичных нервов и эндотелия после пересадки BPCDX.

Показатели у 12 пациентов с кератоконусом в Иране, до и после операции, обратите внимание на число полностью слепых, до операции 6 и после операции 0. А так же появившуюся строку зрение LogMAR lines gained.

а. Фотографии щелевой лампы, до и после операции. b. Оптическая когерентная томография роговицы до и после операции, довольно хорошо видно имплантированный биоматериал BPCDX в Индии была хороший OCT инструмент. c. Результаты топографии роговицы, хорошо видно улучшение толщины и более равномерная поверхность особенно в центральном регионе. 

Результаты у пациентов в индии, все 8 пациентов были полносью слепы на момент операции. И все вернули и сохранили зрение 2 года спустя. Как видите результаты из группы в Индии немного лучше чем в Иране. Одним из возможнных факторов чуть меньшая толщина BPCDX транспланта.

С тех пор как я ушёл из хирургии в науку, мне очень редко удаётся увидеть практические результаты своей работы, но это было особенное ощущение, все эти люди, мужчины и женщины уже второй год могут видеть благодаря нашей работе, это было очень необычное удивительное чувство. В ближайшие несколько лет, когда будут получены разрешающие документы биоматериал будет одобрен для массового клинического применения кератоконус больше не будет забирать у людей возможность видеть этот мир.

Слева направо: Энтони Муквая, Мария Ксерудаки, Доктор Ганнибал, Мирабелли Перфранческо, Нил Лагалли.

Ещё около года мы писали научную статью обрабатывали результаты и перепроверяли статистику, дальше статья ушла в Nature Biotechnology журнал с impact factor 68. Ревизии и проверка данных продолжалась ещё полтора года, журнал проверял и перепроверял каждый эксперимент и каждый результат. Наконец, 11 Августа 2022 года статью опубликовали.

Публикация Rafat, M., Jabbarvand, M., Sharma, N. et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol (2022).
Received: 28 April 2021, Accepted 29 June 2022; Published11 August 2022
DOI https://doi.org/10.1038/s41587-022-01408-w

Про нас довольно много пишут в новостях https://www.nature.com/articles/s41587-022-01408-w/metrics

Подводя итог, BPCDX сейчас проходит одобрение для массового применения в Евросоюзе и США уверен остальные страны поддтянутся за лицензиями на покупку и производство, надеюсь Россия не останется в стороне. Кератоконус перестал быть заболеванием угрожающим зрению. Следующие пять лет мы ождаем сотни тысяч имплантаций по всему миру. Комманда Нила Лагали vs Кератоконус 1:0.

Я молекулярный биолог и достаточно давно работаю с векторами. Поэтому я решил рассказать как устроена Ad5 и Ad26 (Ad 2/6) двухкомпонентная векторная вакцина от COVID-19 (Спутник-5). Официальной информации по вакцине достаточно мало, кроме того, что она векторная и двухкомпонетная, что для большинства людей мало что проясняет. Для начала разберёмся что же такое вектор АД он же Ad он же AAV вектором является аденовирус (или адено-ассоцированный вирус, что сути не меняет). Аденовирусов в природе существует множество, практически все многоклеточные организмы от человека до простейших имеют аденовирусы которые могут заражать их клетки. У людей аденовирусы вызывают респираторные и кишечные заболевания, Вы скорее всего с ними сталкивались.

Причем тут аденовирусы?

Всё дело в том, что генетический код аденовируса изучен и его можно модифицировать, например взять код который кодирует некий белок (белок может быть любым, медузы, змеи, насекомого, полностью синтетический), главное знать его генетический код. Вставим этот код в правильное место в коде вируса, чтобы не нарушить целостность синтаксиса (программисты меня поймут). Код вируса, это генетическая программа достаточно короткая и простая (по сравнению с многоклеточными организмами или тем более человеком) и каждый белок и, соотвественно, функция вируса закодирована в генетическом коде. Теперь когда клетки заражаются таким таким генно-модифицированным аденовирусом они производят белок который мы закодировали. Мы так же не хотим, чтобы наш модифицированный аденовирус самостоятельно размножался, так как при этом он  может взывать заболевание сам по себе, а так же может мутировать с непредсказуемыми последствиями, поэтому мы благоразумно вырежем участок кода, отвественный за разможение вируса. Такой модифицированный вирус называется вектором, он заражает клетки и прозводит в этих клетках нужный нам протеин, это называется трансдукция.

(A) Сетчатка мыши трансдукция контрольным вектором. (B) Сетчатка мыши трансдукция вектором с протеином А. Протеин А (красный сигнал), контрокрашивание ядер DAPI.

Например на этой иллюстрации я собрал вектор на основе АД5 (тот же самый что и в первом компоненте Спутник-5, Вы ведь уже догадались, что цифра 5 в названии вакцины, это от сборки на АД5?) и ввёл сборку в глаза двух мышей 1 микролитр около 1x10^8 копий вектора, (А) одной мыши я ввёл пустой вектор без кода протеина А (это котрольный эсперимент), второй (B) с кодом протеина А. После 5 недель ожидания я извлёк глаза у мышей и попытался обнаружить протеин А в сетчатке с помощью флоуресцентых антител к протеину А. Ядра клеток окрашены DAPI (вещество которые при соединении с ДНК светится в ультрафиолете). Как видите, в сетчатке мыши которой ввели пуcтой вектор сигнал отсуствует и только ДНК в ядрах светится синим, в то же время, мышь которой ввели вектор с кодом протеина А демонстрирует красное свечение в множестве клеток, что указывает, что протеин А в них присуствует, такой метод исследования называется иммунофлуоресцентный анализ или МФА. Производство протеина сохраняется пока живы клетки, зачастую несколько месяцев и даже лет. Клетки вектор не убивает, так как у него остуствует функция разможения. Над разными версиями векторов работают множество лабораторий, обычно их можно приобрести готовыми к рекомбинации (сборке) с кодом нужного белка.

На этой фотография зелёный флоурецентный протен (GFP) с помощью вектора ввели в глаз мыши, а затем выполнили гистологические срезы (глаз поместили в криогель, заморозили и выполнили тончайшие срезы, пригодные для наблюдения под микроскопом). Зелёные клетки сетчатки трансдуцированы (заражены) вектором, производят GFP и светятся зелёным. Это одна из первых научных статей о доставке и трансдукции протеина в сетчатке глаза. Yang и соавторы. https://jvi.asm.org/content/76/15/7651 Слои сетчатки: GL - Ганглиозный слой, INL – внутренний нуклеарный слой, ONL - внешний нуклеарный слой, OS - Внешние сегменты фоторецепторов, RPE - Пигментный эпителий сетчатки.

Кстати код протеина GFP выделен из медузы Aequorea victoria и за это в 2008 году группе учёных совершивших это открытие была присуждена Нобелевская премимя по химии, но это совсем другая история.

Фазово-контрастная фотография здоровой культуры клеток Vero (слева) и после заражения COVID-19 (справа). Белые сгустки - погибшие клетки. Vero - культура клеток почечного эпителия африканской зелёной обезьяны. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.02.972927v1

Опять же, это всё интересно, но какое это имеет отношение к вакцине от COVID-19?

Когда человек заражается COVID-19 в его клетках формируются копии COVID-19 вируса, на них реагирует имунная система и производит антитела, которые в сочетании с другими клетками имунной системы в конечном счёте уничтожают вирус и человек поправляется. Человек переболевший COVID-19 сохраняет иммунитет к повторному заражению некоторое время. Его кровь соддержит антитела и может быть использована в лечебных целях у других заболевших. Проблема в том, что производство антител достаточно медленный процесс, зачастую имунная система просто не успевает и человек погибает от COVID-19 инфекции раньше, чем производство антител набирает обороты (количество антител называется титром). Когда вы болели обычным Гриппом (Influenza) основные симптомы сохраняются около недели иногда и дольше пока имунная система распознает белки вируса и отрабатывает производство антител до достаточного для выздоровления титра. Для разных заболеваний этот процесс занимает разное время.

Помните протеин А, который я произвёл в клетках мыши и потом окрасил антителами? Как эти антитела к протеину А получили? Кролику ввели протеин А, его имунная система отреагировала на присуствие чужеродоного протеина А и затем из сыворотки крови кролика эти антитела отфильтровали, смешали с красным флоуресцентным красителем (примерно тем же как в маркерах для обводки текста) и таким образом я смог получить снимок. Собственно технически кролика вакцинировали протеином А. Есть и другие способы производства антител, но это выходит за рамки этой статьи.

Значит если человку ввести белки COVID-19, но не сам вирус COVID-19 у него появится иммунитет и он не заболеет?

Именно так! Имунная система хорошо распознает вирусные белки, следовательно если выделить белки COVID-19 и ввести человеку, то у него развётся иммунитет. Выделять чистый белок вируса в больших количествах к тому же так, чтобы его не повредить и он сохранил свои свойства для имунной реакции достаточно сложный и дорогой процесс, а вакцины нужно много. Гораздо проще ввести код протеинов COVID-19 в аденовирусный вектор и клетки человека трансдуцированные (заражённые) вектором сами произведут нужный протеин на который отреагирует имунная система. При соотвествующем оборудовании и клетках векторы копируются легко и дёшево в больших количествах. Другой важный момент, векторы производят белок в трансдуцированных клетках на протяжении всей жизни клетки, месяцы, иногда годы после трансдукции, таким образом способствуя длительному сохранению иммунитета. Авторы вакцины сообщают о стойком имунитете длительностью более года.

Теперь давайте разберёмся какой именно протеин закодирован в векторах АД5 и АД26 вакцины Спутник-5.

Взгляните на эту фотографию COVID-19, сделанную электронным микроскопом (вирус невозможно увидеть в световой микроскоп, поскольку он меньше длинны волны света). Однако электроны намного меньше вируса и позволяют получать изображения отдельных вирусов и их структуры. На фотографии (А) вы видите, что поверхность вируса COVID-19 (круглые объекты похожие на картофелины), усеяна пиками (Spike) (B, C, D) этот белок помогает вирусу COVID-19 прикрепляться к клеткам и заражать их. Многие коронавирусы имеют такие пики, собственно поэтому их именно так и назвали из-за внешнего вида на электронной фотографии. Из прошлых исследований коронавирусов, включая тяжёлый острый респираторный синдром (SARS) мы уже знаем, что эти пики вызывают наиболее активное выделение антител и собственно разработка вакцины для SARS так же была основана на основе белков пик, к сожалнию, структура белков SARS и COVID-19 немного отличается, поэтому вакцина от SARS не эффективна против COVID-19.

На английском языке всё очень хорошо и понятно о моллекулярной структуре spike protein изложено вот в этой статье, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7151553/.

(A) Сканирующая электронная фотография COVID-19. (B) Увеличенный фрагмент снимка А. (С) Увеличенная контрастность и размеры отдельной пики (spike). (D) Трехмерная модель структуры Spike protein. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.02.972927v1

Вирус COVID-19 вырастили в культуре клеток, выделили вирусную РНК и считали генетический код COVID-19 с помощью РНК сиквенса. Затем в коде выделили фрагмент отвечающий за производства протеинов пик. Вписали фрагмент этого кода в аденовирусный вектор. Теперь при введении человеку вектора в его клетках будут производится фрагменты пик COVID-19. Обратите внимание только один протеин, и то не целиком, а только иммунопродуцирующий фрагмент, полноценный вирус COVID-19 при этом никак собраться не может, так как генетическому коду для его сборки просто неоткуда взяться. Поэтому заболеть COVID-19 через аденовирсный вектор невозможно. Теперь у нас есть человек, в клетках которого, производятся белок пик COVID-19, его имунная система распознаёт присуствие чужеродного белка пик и начинает производство антител без заболевания.

Почему вакцина двухкомпонентная?

АД5 более подвержен воздействию имунной системы, потому, что помимо антител к протеинам пик, так же вырабатываются антитела с самому АД5. Поэтому после первичного имунного ответа спустя 3-5 недель вводится второй компонент, тот же самый код пик COVID-19 в упаковке АД26, этот вектор меньше подвержен воздействиую имунной системы и производит большее количество протеинов пик. К тому же после взаимодействия с протеинами пик доставленных вектром АД5 уровень антител уже существует и имунный ответ будет более быстрым и стойким (многие вакцины например от Гепатита Б двух или трёхкомпонентные и так же построены на векторах). В резульате мы получили иммунитет к COVID-19. Если теперь уже настоящий COVID-19 попадёт в иммунизированный организм, к протеинам пик COVID-19 немедленно присоединятся антитела которые сформировались против синтетического протеина пик (они идентичные) имунные клетки уничтожат вирус помеченный антителами и вы никогда не поймёте, что несколько часов в вашем теле присутствовал COVID-19. Это и является иммунитетом.

Если это так просто, почему вакцина появилась только сейчас?

Просто это в теории. Требуются длительные эксперименты, чтобы собрать рабочий вектор, убедится что вектор производит нужные белки. В ответ на иньекцию вектора производятся антитела у лабораторных животных. Затем заразить лабораторных животных COVID-19 и убедится что у них развился иммунитет. Произвести исследования на предмет каких либо осложнений у животных. Затем провести эксперименты на добровольцах и убедится в безопасности сборки, всё это требует времени и ресурсов.

Насколько это безопасно?

В целом безопасно, как я уже писал выше абсолютно невозможно заболеть COVID-19 получив векторную вакцину, просто потому, что она соддержит единственный протеин пик и то, его фрагмент, полному вирусу собраться неоткуда. Заболеть аденовирусной инфекцией тоже незвозможно, так как участки кода, отвественные за копирование аденовируса в АД5 и АД26 отсуствуют. С аденовирусами ваш организм за свою жизнь сталкивался множество раз. Возможно кратковременное повышение температуры после введения вакцины, как реакцию организма на присуствие АД5 или АД26. Если вы раньше болели аденовирсной инфекцией краткое повышение температуры можно ожидать уже от АД5. Если нет, то скорее всего повышение температуры будет иметь место после иньекции АД26, так как начальная иммунизация АД5 уже произошла. Наличие крайне малого количества фрагмента протеина пик в вашем организме никакого вреда не несёт. Присуствует так же небольшой риск острой аллергической рекции к АД5 и АД26, но такой же риск существует у любой другой вакцины, употреблении любой пищи или любого препарата. Последний тип осложенений так же крайне маловероятный - риск аутоимунных реакций, он минимален в связи с тем что белки пик COVID-19 чужеродны человеческому организму (это как раз хорошо, было бы очень плохо если они походили например на белки сердечного клапана или клеток поджелуждочный железы, тогда бы заражение COVID-19 вызвало заодно и аутоимунный перекардит или панкреатит, смертность была бы намного выше, а разработка вакцины заняла бы намного большее время, а этого, как вы знаете, не произошло), поэтому риск что антитела сформировавшися против белков COVID-19 могут по ошибке атаковать здоровые человеческие ткани маловероятен.

Если COVID-19 в будущем мутирует означает ли, что вакцина перестанет от него защищать?

Да, Вы правы. Если такая мутация произойдет, то потребуется разработка новой вакцины. Собственно COVID-19 мутирует постоянно, однако эти измнения незначительны с иммунологической точки зрения. Потребуется фундаментальное изменение структуры вируса, что происходит редко и такие мутации не всегда жизнеспособны. Например потеря или значительное измение структуры протеинов пик, так же вероятно, уменьшит и способность вируса к заражению, так как пики используются для прикрепления вируса к клеткам. На сегодняшний день протеин пик идентичен для всех на известных серотипов (мутаций) COVID-19.

Насколько было оправданно внедрить векторную вакцину сразу после стадии клинических испытаний II (несколько сотен добровольцев) без полномасштабных клинических исследований стадии III (несколько тысяч)?

В США для борьбы с COVID-19 правительством был досрочно одобрен к применению у больных COVID-19 препарат chloroquine, эффективность которого в отношении COVID-19 не была достоверно доказана  и впоследствии ислледования подтвердили, его низкую эффективность, поэтому препарат был отозван и более при COVID-19 не применяется). В то же время Спутник-5 достоверно вызвает имунный ответ и устойчивость к заражению COVID-19, что было подтвержденно на стадии I и II клинических испытаний, работа над клиническими исследованиями стадии III уже проводится, но вакцина, вероятно, будет доступна населению РФ до завершения стадии III. Как биолог, в целом я считаю такое решение оправданным риском.

По своей архитектуре вакцина сравнительно безопасна, АД5 и АД26 используются в научной работе, генной терапии и во множестве других вакцин по всему миру. По сути 90% кода вакцины это давно проверенный код вектров АД5 и АД26 с включением фрагмента протеина пик по которому была проведена серьёзная научная работа. В то же время существует опасное заболевание COVID-19 которое уже унесло жизни миллионов человек по всему миру и каждый день эта цифра увеличивается. Скорейшая вакцинация населения страны и прекращение эпидемии имеет так же крайне важный социально-экономический аспект.

Стоит ли мне вакцинироваться от COVID-19 вакциной Спутник-5?

Решение получить вакцину от COVID-19 или нет остаётся за вами, я бы только хотел, чтобы это было осознанное решение, с пониманием, что это такое и какие биологические процессы произойдут в вашем организме после введения Спутник-5. Я надеюсь, что эта статья помогла вам.

Примечание 1: Я не имею отношения к научной группе участвовашей в разработке вакцины Спутник-5. Значительная часть информации основана на моём опыте работы с АД5 и АД26 векторах и основных принципах трансдукции, генной терапии, разработки вакцин, иммунологии и вирусологии. Если у вас есть дополнительная информация по Спутник-5 или коррекции по данному тексту, пожалуйста отпишитесь в комментариях.

Примечание 2: Я старался писать этот материал максимально доступным языком, но если вам что-то непонятно, дайте знать, я попробую объяснить подробнее.

Примечание 3: Статья Lui и соавторов "Viral Architecture of SARS-CoV-2 with Post-Fusion Spike Revealed by Cryo-EM" https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.02.972927v1 из которой представленны фазово-контрастные фотографии здоровой культуры Vero и заражённой COVID-19, а так же  электронные микрофотографии COVID-19 и Spike protein находится в стадии Preprint и ещё не прошла академическое рецензирование. В то же время я счёл фотографии достаточно наглядными и достоверными для включения их в этот материал. 

Примечание 4:  Если после прочтения материала вам все равно ничего не понятно, пожалуйста ознакомьтесь с упрощённым переводом материала от @Zerokko на Пикабушный язык #comment_177412091

"Вы взяли давно и хорошо изученный аденовирус (ОРВИ или что-то подобное), отрезали у него хер с яйцами, чтобы он не мог размножаться в организме. Потом вы отрезали причиндалы у коронавируса и пришили их к аденовирусу вместо отрезанных. Т.к. хер у аденовируса чужой, тот не то что оплодотворить никого не способен, у него вообще не стоит. И вот, подплывает этот вирус со своим вялым членом к здоровой клетке, пытается её поиметь, а нихрена не получается. Клетка орёт, ей на помощь приходят антитела, вирусу дают люлей, его хер фоткают, и теперь, когда в организм проникает Ковидка, его по причиндалам узнают и сразу дубасят. Антитела и на сам Ковид всё равно бы среагировали, но он бы успел трахнуть много клеток, родилось бы ещё больше ублюдков, и был бы тяжелый ущерб организму.".

Примечание 5:

После публикации мне не раз задавали вопрос. "А вы сами то будите вакцинироваться?" Теперь у меня есть на него ответ. Я получил вакцину Pfizer две дозы. Я бы предпочёл Спутник-5 так как она вызывает меньше побочных эффектов, но на моей территории она недоступна. Первая доза вызвала лёгкий дискомфорт в месте укола, но в целом прошла для меня незамеченной. Вторая доза вызвала повышение температуры, озноб, головную боль, тошноту около 2 дней. Уровень симптомов как при сильной простуде (без кашля или заложенности носа) если бы не выходные я бы взял больничный. Симптомы ослабли и полностью исчезли, теперь я защищён от COVID-19. И могу посещать публичные места не опасаясь тяжёлой болезни или смерти, носить маску по социальным причинам, а не из страха заражения. Насколько я знаю, Спутник-5 вызвает схожие или меньше симптомы при применении.

Не успели мы посмеяться, над фейковыми новостями о создании эмбриона Т-рекса из куринного яйца, как в журнале National Science Review с импакт фактором 13.222 вышла научная статья Alida M. Bailleu и соавторов, под названием "Evidence of proteins, chromosomes and chemical markers of DNA in exceptionally preserved dinosaur cartilage" - "Признаки наличия белков, хромосом и биохимических маркеров ДНК в исключительно хорошо сохранившемся хряще динозавра" представляет доказательства сохранности белков и нуклеиновых кислот в образце динозавра Hypacrosaurus stebingeri (на иллюстрации) возрастом около 65 миллионов лет. https://academic.oup.com/nsr/article/doi/10.1093/nsr/nwz206/5762999

Fig 1. Внешний вид образцов динозвра Hypacrosaurus stebingeri и контрольного образца (современного страуса Эму) микроскопическое обнаружение объектов напоминающие хромосомы и делящиеся клетки.

А. Общий вид образца Hypacrosaurus(MOR 548) шейного позвонка. B. Микрофотография кальцинированных хрящевых лакун. C-D  структуры напоминающие делящиеся клетки и хромосомы динозавра под большим увеличением. E. контрольный образец шейного позвонка современного страуса Эму. F. Хрящевая ткань контрольного образца. G клетки замершие в процессе деления и хромосомный материал в контрольном образце.

Fig 2. Окрашивание Алкианским синим (маркер хрящевой ткани) срезов образца динозавра и сорвменного страуса.

Внешний вид образцов A. хрящевой ткани динозавра и B кости динозавра. Окрашивание Алкианским синим хрящевой ткани C выявляет синее окрашивание (типичное для хондроцитов, клеток хрящевой ткани). D. Минимальное окрашивание костной ткани динозавра Алкианским синим. E-H контрольные образцы страуса эму, так же показывают ярко синее окрашивание хрящевой ткани и минимальное костной.

Данный результат показывает что в образцах действительно хрящь динозавра а не какая-то другая ткань.

Fig 3. Обнаружение ДНК в хондроцитах (клетках хряща) динозавра Hypacrosaurus stebingeri

Клетки хрящевой ткани динозавра (A-B), окрашивание Propidium iodide (С) и DAPI (D) на присутствие ДНК/Нуклеиновых кислот. (E-G) Контрольные образцы страуса Эму.

Fig 4. Обнаружение протеина Chick Collagen II в материале хряща динозавра Hypacrosaurus stebingeri

A-D. Иммунофлуоресцентный анализ антителами к протеину Chick Collagen II (зелёный сигнал) в ультратонких срезах материала Hypacrosaurus stebingeri и хряща современного страуса Эму (E-H). Чтобы подтвердить, что это именно коллаген II, авторы обработали образцы динозавра (C-D) и страуса Эму (G-H) коллагеназой II которая специфически разлагает коллаген II и получили ожидаемое снижение интенсивности сигнала. Чтобы подтвердить, что это именно коллаген II, а не какой либо другой протеин с которым антитела связываются неспецифически, авторы окрасили те же образцы антителами к коллагену I который в хрящевой ткани в норме не пресутствует и не получили сигнала. В дополнительных материалах к статье представлена так же контрольное окрашиве без антител к Chick Collagen II чтобы исключить неспецефическое окрашивание образца вторичными антителами с флоуресцентным маркером (зелёным хромофором) которые спецефически связываются с первичными антителами к Chick Collagen II, отсутсвие сигнала в контрольном образце подтвердило, что это действительно Chick Collagen II, а не случайное явление.

После прочтения статьи, из моей личной критики очень хотелось бы увидеть окрашивание Propidium iodide и DAPI образцов на котором видны хромосомы (Fig 1), оба красителя их должны окрашивать. Однако вероятно хромосомы замершие в процессе деления могли подвернуться большей деградации чем упакованные в ядре клетки и сохраниться только внешне без содержания нуклеиновых кислот. В плане внешнего вида окрашенного материала именно так ядра клеток и выглядят. Не могу не отметить, что ядро динозавра выглядит значительно меньше нормального ядра в обычной клетке современных млекопитающих, в соотношении размера ядра к клетке, но поскольку мы имеем дело со столь древним образцом возрастом миллионы лет малый размер может быть связан с деградацией в образце нуклеиновых кислот .

Данные результаты ставят под сомнение опубликованные в 2012 году Morten E. Allentoft и соавторами, предположения о периоде полураспада ДНК порядка 500 лет и принципиальную невозможность выделения и изучения ДНК динозавров. https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.1098/rspb.2012.1745. Разумеется от обнаружения нуклеиновых кислот, до полноценного или хотя бы частичного генома динозавра огромная пропасть. Тем не менее логичный следующий этап это вырезать ядра клеток из образца лазером и попробовать извлечь ДНК для проведения геномного сиквенса и совмещение с референсным геномом птиц, того же страуса Эму. Насколько часто в архивах встречаются образы сохранности приемлемого для выделения белков и нуклиновых кислот и  в каких условиях пребывал образец, что позволили выявить белки и нуклеиновые кислоты требует дополнительного изучения.