user8492569

Что касается массообмена, происходящего во время экстракции, повышение температуры вызовет падение вязкости экстракционного раствора, что приведет к увеличению общей скорости массообмена. Тем не менее, повышение температуры выше точки денатурации коллагена приведет к термической деградации выделенных белков. Извлечение коллагена из рыбных источников в основном осуществляется при температуре от 4 до 10 °C, что позволяет пепсину расщеплять поперечные связи в тройной спирали коллагена, не повреждая структуру пептидов.

4.2. Влияние времени экстракции

Влияние времени экстракции на выход коллагена можно объяснить с точки зрения скорости массообмена. Извлечение строго контролируется процессом диффузии, который зависит от времени; следовательно, извлечение коллагена будет увеличиваться с увеличением времени экстракции.

Тем не менее, чрезмерная продолжительность экстракции может привести к деградации выщелачиваемых пептидов. В таком случае кислотный раствор начинает разрушать цепочки коллагена, провоцируя их разложение и снижая конечный выход экстракции. Кроме того, длительное время экстракции сделало бы процесс экстракции непригодным для промышленного масштабирования. Например, Арумугам и др. сообщили, что выход коллагена из кожи единственной рыбы увеличивался с течением времени, но затем выход снижался. Оптимальное время для достижения максимального выхода составляло 36 часов. Однако в другом исследовании увеличение времени экстракции изменило выход с 15,3 до 19,3%.

Кроме того, Альфаро и др. исследовали оптимальные условия для извлечения коллагена из тиляпии Вами. Оценивалось влияние четырех параметров, таких как концентрация NaOH, концентрация H2SO4 и температура экстракции, а также время экстракции. Влияние времени выделения изучалось в разное время (3-15 ч), и результаты показали, какое время оказывает существенное влияние, так что увеличение времени экстракции с 3 до 15 ч привело к увеличению выхода на 1,72%.

4.3. Влияние концентрации растворителя

Большинство методов извлечения коллагена AcOH проводились с использованием 0,5 М AcOH. Более высокая молярность может вызвать деградацию пептидов, тем самым снижая как выход, так и чистоту конечного продукта. Арумугам и др. изучали влияние концентрации AcOH на выработку коллагена из кожи камбалы, используя диапазон концентраций от 0,2 до 1 Мкм, в то время как все остальные экспериментальные переменные оставались постоянными. Когда концентрация AcOH достигла 0,6 М, выход коллагена увеличился до 16 мг коллагена/ г рыбьей кожи. За пределами 0,6 М выход коллагена снизился до 12,5 мг коллагена / г рыбьей кожи из-за эффекта разложения, вызванного избытком кислоты.

Кроме того, для извлечения коллагена можно использовать другие органические кислоты, такие как лимонная и молочная. Неорганические кислоты (например, HCl) также могут применяться для извлечения коллагена; однако их эффективность ниже по сравнению с органическими кислотами. Органические кислоты более эффективны в солюбилизации несшитого коллагена и разрушении некоторых межцепочечных сшивок в коллагене. Таким образом, из-за низкой стоимости и превосходных эксплуатационных характеристик AcOH является наиболее используемым органическим растворителем для выделения коллагена из рыбных субпродуктов.

Еще одним важным фактором, связанным с извлечением AcOH, является действие пепсина, используемого для разрезания телопептидных концов тройной спирали коллагена. Нельзя пренебрегать влиянием концентрации пепсина (от 1 до 10%): большее количество молекул фермента увеличивает скорость расщепления концов телопептидов, тем самым ускоряя выщелачивание и гарантируя более эффективное извлечение коллагеновых пептидов. Когда концентрация пепсина достигает порогового значения (около 10%), которое зависит от природы и количества используемого исходного материала, все участки телопептида подвергаются расщеплению. В таком случае, увеличение количества пепсина выше порогового значения может снизить выход экстракции, поскольку это приведет к разложению солюбилизированных молекул коллагена.

4.4. Влияние соотношения твердого вещества к жидкому

Соотношение S / L определяется как количество твердого источника коллагена, деленное на массу жидкого раствора, используемого для экстракции. В целом, увеличение количества раствора усиливает взаимодействие между свободными протонами и аминокислотами коллагеновых цепей, тем самым улучшая расщепление поперечных связей, присутствующих в коллагеновой спирали. Уменьшение соотношения твердого вещества к жидкому увеличивает скорость деполимеризации пептидов, поскольку большое количество кислоты приводит к фрагментации цепей коллагена, в результате чего получается продукт, богатый пептидами с более низкой молекулярной массой. Поскольку размер молекул этих белков в значительной степени определяет их функциональность в биологических процессах, соотношение твердого вещества и жидкости необходимо регулировать с учетом применения выделенного продукта.

В некоторых исследованиях использовалось соотношение S / L от 1/40 до 1/50, что ниже по сравнению с другими исследованиями, где использовалось соотношение твердого к жидкому, равное 1/10. По мере увеличения количества растворителя ткани рыбы будут подвергаться воздействию большего количества свежего раствора, тем самым повышая скорость солюбилизации коллагеновых пептидов. Различные соотношения S / L, такие как 1/25, 1/35, 1/45, 1/55 и 1/65, использовались для изучения влияния соотношения S / L на выход экстракции растворимого в пепсине коллагена из кожи гигантского горбыля (Nibea japonica) при концентрации пепсина 1200 Ед / г и времени гидролиза 8 ч в 0,5 М AcOH Yu et al. (Рисунок 4). Выход экстракции был значительно увеличен при увеличении соотношения S/ L с 1/25 до 1/55, так что соотношение 1/55 было выбрано в качестве оптимального условия. Затем, при увеличении соотношения S / L с 1/55 до 1/65, выход экстракции был снижен. Сообщается, что оптимальное соотношение твердого вещества к жидкости для экстракции AcOH составляет примерно от 1/40 до 1/60.

Рисунок 4

Влияние времени и соотношения твердое /жидкое вещество на выход коллагена из (a,d) кожи трески, (b,e) кожа единственной рыбы, перепечатано с разрешения Elsevier (4851440916595), и (c,f) кожа гигантского горбыля, перепечатано с разрешения (Creative Common CC ПО лицензии открытого доступа.)

5. Другие методы извлечения

Хотя методы кислотной экстракции являются основными подходами к выделению коллагена, высокая кислотность, длительное время обработки и высокая температура при методах кислотной экстракции могут негативно влиять на высокую степень деградации растворимых цепей коллагена. Поэтому необходимо исследовать новые технологии обработки, которые позволяют лучше сохранять целевые пептиды. Следовательно, многие исследователи сосредоточили свое внимание на разработке инновационных и устойчивых методов извлечения для достижения более высоких выходов коллагена с использованием дешевых и менее токсичных материалов.

5.1. Глубокая экстракция эвтектическим растворителем (DES)

DES представляет собой смесь двух соединений: одно действует как акцептор водородных связей (HBA), в то время как его партнер действует как донор водородных связей (HBD). Метод DES в основном основан на обильных, малотоксичных и биоразлагаемых природных компонентах (хлорид холина, щавелевая кислота, мочевина, этиленгликоль), которые делают DES особенно подходящим для извлечения ценных химических веществ из побочных продуктов животного, морского и растительного происхождения.

Из шести различных DES, исследованных Bai et al. (2017), смесь хлорида холина (CC) и щавелевой кислоты (OA) оказалась наиболее эффективной, продемонстрировав эффективность извлечения, близкую к 90% для кожи трески. Это значение почти в четыре раза превышает выход экстракции, полученный при извлечении AcOH из кожи тилапии (27,2%). Таким образом, сорастворитель CC-OA представляет собой устойчивую альтернативу для выделения коллагеновых пептидов из побочных продуктов морской переработки.

Соотношение CC/OA в методе экстракции DES существенно влияет на эффективность извлечения коллагена. Различные соотношения CC/OA были протестированы в диапазоне от 1/0,6 до 1/1,4, при этом анализируемые системы поддерживались при одной и той же температуре (т.е. 45°C). Сначала при увеличении количества щавелевой кислоты при постоянном количестве хлорида холина наблюдалось повышение эффективности экстракции до достижения соотношения 1/1; затем было измерено небольшое снижение выхода. По мере увеличения количества щавелевой кислоты увеличивается и количество свободных протонов в растворе, что приводит к увеличению числа взаимодействий со спиралями коллагена и облегчает вымывание пептидов. Тем не менее, щавелевая кислота также увеличивает вязкость раствора до тех пор, пока это отрицательно не скажется на скорости массообмена.

Кроме того, Бай и др. исследовали влияние температуры экстракции CC-OA на выход коллагена из шкурок трески. Эффективность извлечения коллагена неуклонно возрастает с повышением температуры, пока не достигнет плато от 65 до 75 °C. Более высокие температуры вызывают снижение вязкости раствора, что увеличивает коэффициент массопередачи и, следовательно, скорость выщелачивания. Кроме того, повышение температуры улучшило чистоту получаемого коллагена до достижения минимальной точки, соответствующей 55 °C. Кроме того, благодаря усиленной полимеризации цепей коллагена при температуре выше 55 ° C эффективность повышается до 95,68%.

Было проведено сравнение влияния времени экстракции и соотношения S/ L на выход коллагена при трех способах выделения, включая DES, кислотный и пепсинизированный AcOH из кожи трески, кожи камбалы и кожи гигантского горбуна (рисунок 4 a–f). Выход коллагена при процедурах экстракции AcOH и DES с использованием пепсина был выше (около 85% при соотношении 1/55 Л/Л), чем при процедурах кислотной экстракции. Однако наибольшая эффективность принадлежит экстракции DES (99,72%). Хотя выход коллагена сначала увеличивался, а затем со временем уменьшался при методе кислотного выделения, при двух других подходах это количество увеличивалось на ранней стадии, а затем оставалось постоянным или увеличивалось с небольшим наклоном.

5.2. Сверхкритическая жидкостная экстракция (SFE)

Сверхкритическая жидкостная экстракция (SFE) стала одним из самых популярных экологически чистых методов извлечения химических соединений. Сообщалось о нескольких преимуществах сверхкритической жидкостной экстракции по сравнению с традиционными или классическими процессами экстракции, таких как улучшенная селективность, более высокие выходы экстракции, лучшие возможности фракционирования и меньшее воздействие на окружающую среду. SFE основан на использовании жидкости при давлениях и температурах, превышающих критическую точку, для достижения значительных физических изменений, которые изменят его возможности в качестве растворителя. CO2 является наиболее часто используемой молекулой для метода SFE из-за низкой токсичности, экономической эффективности, высокой доступности, стабильности, воспламеняемости, приемлемости для окружающей среды и мягких условий эксплуатации (умеренное давление и температура). Кроме того, после экстракции из водной среды может выделяться СО2, и, следовательно, будет получено очищенное соединение. В последнее время SFE используется для извлечения коллагена из морских отходов вместо традиционной экстракции на основе кислоты.

Сообщалось, что для кожи трески выход коллагена составляет 13,8, 5,72 и 11,14%, при этом эти значения были получены с помощью процедур экстракции SFE, AcOH кислотой и пепсином соответственно. В другой работе SFE использовался для выделения коллагена и желатина из морских губок. Для достижения наивысшего выхода условия эксплуатации были оптимизированы таким образом, чтобы выход коллагена составлял приблизительно 10%.

5.3. Экструзия и экстракция коллагена с помощью ультразвука

Высокотемпературные процессы короткого действия (HTST) и с высоким усилием сдвига - это две характеристики экструзионной варки, которые уже много лет используются для производства продуктов питания для людей и кормов для животных. Формование и вспучивание зерновых культур, приготовление в пищевой промышленности и текстурирование белков могут осуществляться методом экструзионной варки. За процессом экструзии следуют различные реакции, такие как термическая обработка, денатурация белка, измельчение, гидратация, желатинизация, сдвигание, смешивание, придание формы, вспучивание, частичное обезвоживание, изменение текстуры и уничтожение микроорганизмов или других токсичных соединений. Как правило, некоторыми из существенных преимуществ экструзионной варки являются простота в эксплуатации, непрерывность производства, небольшие затраты труда, низкие трудозатраты и ограниченное количество отходов, а также разнообразие продуктов. В результате метод экструзии может быть использован для предварительной обработки для извлечения коллагена из рыбных субпродуктов. Экструзионно-гидроэкстракционная обработка (EHE) направлена на повышение растворимости цепей коллагена, присутствующих в образце, с использованием предварительной экструзионной обработки. Хуанг и др. сообщили, что высокое давление, достигаемое в чешуе тилапии во время экструзии, обеспечивает выход коллагена от 7,5 до 12,3%, что в 2-3 раза выше, чем при обычной процедуре экстракции AcOH.

Однако другие исследования были сосредоточены на использовании предварительной обработки ультразвуком для повышения экстрагируемости коллагеновых пептидов. Ультразвук вызывает кавитацию в жидком растворителе, образуя микропузырьки, сжатие которых повреждает ткани рыбы и увеличивает площадь контакта между жидкостью и твердым веществом в диапазоне волн от 20 до 1000 кГц. Силы сдвига, создаваемые кавитационными пузырьками, зависят от их размера, так что с увеличением частоты ультразвука размер пузырьков уменьшается, а силы сдвига увеличиваются. Zou et al. сообщили, что выход коллагена, экстрагированного из мягкошерстного калипаша черепахи, увеличился на 16,3% при использовании предварительной обработки ультразвуком (24 мин, 200 Вт и 24 кГц ультразвука) по сравнению с выходами, измеренными при обычной экстракции AcOH. Таким образом, оба метода положительно влияют на конечный выход коллагена и должны быть изучены в будущих исследованиях.

6. Методы определения характеристик коллагена

Как правило, хорошее знание и характеристика коллагена, выделенного из морских видов, приведет к установлению логической взаимосвязи между результатами и особенностями структуры. Это может помочь исследователям контролировать результаты, изменяя структуру. Для характеристики морского коллагена (в растворе или твердом состоянии) можно использовать несколько методов, учитывающих структурные, химические и морфологические свойства.

6.1. Химический состав коллагена

Инфракрасное преобразование Фурье (FTIR) - это инструмент, который используется для оценки и распознавания присутствия коллагена и химического состава, а также для определения его типа. Более того, его можно использовать для сравнения состава коллагена, извлеченного с помощью различных подходов, или для исследования влияния методов выделения на состав коллагена. Например, Чуайчан и др. изучали ИК-спектры коллагенов, извлеченных с использованием процедур экстракции AcOH кислотой и пепсином из чешуи морского окуня. Спектры ИК-спектроскопии показали, что анализируемый коллаген соответствует типу I, и показали, что функциональные группы, присутствующие в тройной спирали, не были повреждены применяемыми методами обработки. Таким образом, процесс экстракции не затронул функциональные группы. Тем не менее, можно заметить различия в ширине и высоте соответствующих сигналов на нескольких графиках, что может быть связано с различными экспериментальными условиями каждого исследования (например, с разными растворителями с разной концентрацией). Почти весь коллаген, извлеченный из морских видов, был типа I.

6.2. Характеристика чистоты коллагена и его распада

Электрофорез, такой как электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), обычно используется для идентификации структуры белка и определения молекулярно-массового распределения коллагеновых пептидов. С помощью этого инструмента можно отделять белки и их фрагменты друг от друга в зависимости от их размера. Хотя белок с более крупной цепью удерживается в геле, мельчайшие фрагменты проходят через гелевую сетку. Определение типа коллагена путем сравнения коллагенов, полученных из других источников в качестве эталона, возможно, когда коллагеновые полосы похожи. Кроме того, возможна идентификация аминокислотных последовательностей в коллагене того же типа. Коллаген, состоящий из трех альфа-цепей, может быть как одной, так и разными альфа-цепями в зависимости от типа коллагена. Например, коллаген I типа состоит из двух цепей альфа-1 и одной цепи альфа-2, в то время как коллаген II типа содержит три цепи альфа-1. Более того, димеры (β-цепи) или тримеры (γ-цепи) можно найти на СТРАНИЦЕ SDS на основе их сборки и посттрансляционной модификации. Как правило, рыбий коллаген состоит из двух цепей альфа-1 и одной цепи альфа-2 (около 100 кДа).

Более того, димеры (161 кДа) и тримеры были обнаружены у различных выброшенных видов рыб (рыба-кролик, скат кукушка, обыкновенный атлантический гренадер). В отличие от других видов, у рыбы-кролика наблюдается очень слабый пик бета-компонента, а альфа-2-компоненты практически не видны.

Результаты получения коллагена SDS-PAGE из чешуи тилапии с помощью двух подходов, процедур acid и EHE, показаны на рисунке 5. Используемый метод экстракции не влияет на молекулярно-массовое распределение коллагеновых пептидов. Кроме того, интенсивность полосы α1 была в 2 раза выше, чем у α2. Это связано с наличием двух идентичных субъединиц α1 и одной из α2 в коллагене I типа. Как показано на рисунке 5, молекулярные массы цепей α2 и α1 в каждом случае находились в пределах 116-121 кДа и 126-132 кДа соответственно. Вместо этого бета-диапазон был расположен на более высоком уровне (приблизительно 255 кДа).

Рисунок 5

(a) Белковая структура кислоторастворимого коллагена из кожи и чешуи тилапии. Перепечатано с разрешения Elsevier (4851441506573), и (b) структура белка для процедур экструзии-гидроэкстракции (EHE) из кожи тилапии. Перепечатано с разрешения Elsevier (4851450130304).

7. Применение биоматериалов из морского коллагена

Благодаря растворимости в воде, безопасности, биосовместимости, биоразлагаемости и легкой экстрагируемости, а также низкой иммуногенности морской коллаген привлек научное внимание для применения в качестве биоматериала. С другой стороны, из-за огромного количества побочных продуктов из морских отходов, таких как рыбья кожа, кости, чешуя, хрящи и головы, морской коллаген используется в различных областях применения биоматериалов, таких как разработка костных тканей, тканевая инженерия и регенерация кожи, тканевая инженерия хряща, перевязка ран, доставка лекарств и т.д.

Одной из основных целей тканевой инженерии является регенерация поврежденных, больных или удаленных органов и тканей с использованием пористых, биосовместимых и биоразлагаемых каркасов. Регенерация кости включает в себя формирование и резорбцию кости, что является сложным физиологическим процессом. Травмы, инфекции, аномалии скелета, резекция опухоли, некроз сосудов, атрофические несращения и остеопороз являются факторами, вызывающими дефекты и повреждения костей. Имплантация аллотрансплантата, остеокондуктивных каркасов, клеток-остеопрогенераторов, свободного васкуляризированного трансплантата малоберцовой кости и дистракционный остеогенез - это несколько различных стратегий усиления процесса регенерации кости. Остеогенная активность каркаса, изготовленного из морского коллагена, была изучена для применения в инженерии костной ткани. Эланго и др. извлекли коллаген из хряща голубой акулы, а затем приготовили три типа каркасов из его коллагена, включая коллаген, коллаген–хитозан и коллаген–гидроксиапатит. Были исследованы физико-функциональные свойства, механические свойства, биосовместимость и остеогенез каркасов. Образец коллагена и гидроксиапатита имел жесткость 8,95 МПа, водосвязь 231%, хорошую биосовместимость и низкую скорость биодеградации. Для определения дифференцировки кости и минерализации каркасов исследователи использовали активность щелочной фосфатазы (ALP) после 3 дней инкубации клеток остеобластов (hFOB). ALP коллаген–гидроксиапатита составлял приблизительно 35 Ед/ л, что было выше, чем активность ALP в других образцах. В другой работе была изготовлена нановолокнистая мембрана из поли (молочнокислокогликолида), которая была дополнительно модифицирована различными весовыми пропорциями рыбьего коллагена с низкой иммуногенностью (1:100, 5:100, 10:100, и 15:100) и наногидроксиапатит (5:100, 15:100 и 25:100). Прочность на разрыв образца нановолокна из-за взаимодействия рыбьего коллагена и поли (молочнокислого ко-гликолида) значительно повысилась, так что прочность на разрыв образца 5:100 составила 6,5 МПа, что в шесть раз превышает прочность на разрыв образца на основе поли (молочнокислого ко-гликолида). Более того, рыбий коллаген ускорил биоразлагаемость, так что масса, оставшаяся в образцах нановолокон с рыбьим коллагеном через 70 дней, составила 75%, в то время как оставшаяся масса нановолокон с поли (молочнокислым со-гликолидом) составила 90%. Результаты показали, что образцы с массовыми соотношениями рыбьего коллагена и наногидроксиапатита 5:100 и 15:100 соответственно обладали самой высокой активностью ALP.

Поскольку хрящ не обладает способностью к самовосстановлению, инженерия хрящевой ткани пытается восстановить поврежденный или больной суставной хрящ. Pugliano и др. показали, что коллагеновый имплантат из медузы можно использовать для регенерации хряща с помощью терапевтических молекул. Более того, Mredha и соавт. успешно разработали коллагеновую фибриллу на основе коллагена, экстрагированного из плавательного пузыря осетровых рыб. Они разработали гидрогели на основе двойной сетки. Гидрогели с двойной сеткой обладали превосходными механическими свойствами, которые имели модуль Юнга в диапазоне от 0,26 до 0,93 МПа, температура денатурации, основанная на кривой DSC, была повышена даже до 90 ° C, а также имели хорошие биомеханические характеристики in vivo. Таким образом, они предположили, что этот гидрогель можно использовать в качестве искусственного хряща.

Коллаген, полученный из морских видов, также может быть использован в других областях тканевой инженерии, таких как стоматологическая, сосудистая и роговичная. Ван и др. использовали коллаген I типа в качестве кровеносных и лимфатических сосудов, который был извлечен из чешуи рыбы, модифицирован и сшит метилированием и 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром соответственно. Исследования In vivo в условиях, свободных от факторов роста, показали благоприятное взаимодействие между образцом коллагена и окружающей тканью. Лю и др. исследовали in vitro функциональность коллагена рыбы тилапии для регенерации тканей пародонта. Результаты культивирования клеток пародонтальной связки человека с гидролизованным рыбьим коллагеном были исследованы с использованием остеогенных маркеров ALP, COL I, RUNX2 и OCN на генном уровне, и продукция связанных с остеогенезом белков выявила благоприятную жизнеспособность клеток и остеогенную дифференцировку.

Более того, Кришнан и соавт. использовали морской коллаген для регенерации тканей роговицы. Они использовали коллаген из чешуи рыбы (L. calcarifer) для изготовления каркаса; затем они оценили его физико-химические, механические и культуральные характеристики и сравнили его с идеальной заменой амниотической мембраны человека. Морфология лимбальных клеток на коллагеновом каркасе рыб на 48-м часу показала быструю миграцию эпителия, хотя аналогичный результат миграции клеток на амниотической мембране человека наблюдался через 72 часа. Согласно данным кинетики роста, на 10-й день площадь роста коллагенового каркаса рыбы составляла 425 мм2, а амниотической мембраны человека - 300 мм2. Авторы предположили, что каркас может быть использован в качестве кандидата для тканевой инженерии роговицы.

Еще одно применение рыбьего коллагена - в системе доставки лекарств. В настоящее время исследователи пытаются доставлять лекарственные препараты в определенные ткани или органы организма, тем самым уменьшая или устраняя значительные проблемы, такие как плохая биодоступность, стабильность, растворимость и всасывание. Чтобы улучшить биодоступность аллопуринола как лекарственного средства для лечения подагры и высокого уровня мочевой кислоты в организме человека, Нгуен и соавторы подготовили чувствительный к рН гидрогель на основе коллагена из рыбьей чешуи и каррагинана в качестве лекарственного носителя. Этот гидрогель может улучшить биологическую активность и физические свойства препарата в имитируемых жидкостях организма. Высвобождение препарата из носителя происходило в 1,5-6,7 раза медленнее, чем в контрольном образце. В другой работе гидрогелевые микроиглы из сшитого коллагена рыбьей чешуи получали с использованием модифицированного метода низкотемпературного прессования, и в них загружали глюконат железа. В фосфатном буферном растворе (PBS) он набухал до 340% от первоначальной массы и высвобождал 34,5% введенного лекарственного средства в течение 24 ч. Морской коллаген можно использовать одновременно в качестве повязки для ран и носителя лекарственного средства. Например, куркумин добавляли в коллаген из рыбьей чешуи и наногель Hyp-метилцеллюлозы для заживления ран. Наногель, содержащий куркумин, показал профиль пролонгированного высвобождения и более высокую способность к заживлению ран.

8. Выводы и перспективы на будущее

Устойчивая биомасса и революционные биотехнологии не только уже вносят существенные изменения в жизнь человека, но и открывают перспективу для будущих исследований в некоторых разделах морских и пищевых наук, химической инженерии, биотехнологии и фармацевтики. Большое разнообразие применений коллагена и его важная роль в будущем тканевой инженерии делают его ключевым биополимером для здоровья и благополучия человека. Учитывая высокий спрос на коллаген, существует настоятельная необходимость в поиске устойчивых и более дешевых источников производства коллагена, а также в сокращении использования животных. Морская биомасса становится все более привлекательным источником коллагена. Однако вариации состава в зависимости от источника, низкая температура плавления морского коллагена и низкие температуры денатурации ограничивают его применение. Следовательно, понимание физико-химических и биологических свойств морского коллагена, а также методов экстракции и очистки в значительной степени помогло бы решить эти проблемы, связанные с морским коллагеном. В этой статье сначала были обобщены структура и стабильность морского коллагена позвоночных и беспозвоночных животных. Затем были рассмотрены различные методы экстракции коллагена, включая кислотную экстракцию, экстракцию AcOH пепсином, глубокую экстракцию эвтектическим растворителем, экстракцию сверхкритической жидкостью, экструзию и экстракцию с помощью ультразвука, а также параметры экстракции, влияющие на выход коллагена, такие как температура, время, растворитель и соотношение твердого вещества и жидкости. Среди различных методов экстракции глубокая экстракция эвтектическим растворителем является перспективным методом экстракции для будущих исследований; однако условия экстракции должны быть оптимизированы для получения более высокого выхода экстракции.

Затем были обсуждены некоторые типичные методы определения характеристик морского коллагена, в основном FTIR, SDS-PAGE, хроматографические методы и DSC. Благодаря биосовместимости, водорастворимости, безопасности, способности к биологическому разложению, антимикробной активности и функциональности морской коллаген привлекателен для применения в биоматериалах, включая перевязку и заживление ран, доставку лекарств, терапию, тканевую инженерию и регенерацию.

В будущем исследовании необходимо изучить физико-химические свойства морского коллагена и влияние на свойства таких факторов, как методы экстракции. Для получения подходящих биоматериалов из морского коллагена необходимо провести исследование новых физических, химических и ферментативных изменений в структуре морского коллагена. Кроме того, изучение инструментов для генетической характеристики и внедрение морских источников коллагена откроет новую эру в производстве настраиваемого коллагена для тканевой инженерии и других биомедицинских применений в ближайшем будущем.

Коллаген является наиболее распространенным структурным белком во внеклеточном матриксе различных соединительных тканей организма (т.е. Кожи, костей, связок, сухожилий и хрящей) (Рисунок 1а). Основное биомедицинское применение коллагена находилось в биоматериалах, особенно в качестве носителей лекарств и генов, тканевой инженерии, рассасывающихся хирургических швах, остеогенных материалах и костных пломбировочных материалах, гемостатических средствах, иммобилизации терапевтических ферментов и повязках для покрытия ожогов / ран. Коллаген является важнейшим компонентом процесса заживления ран; он действует как естественный структурный каркас или субстрат для роста новых тканей и играет важную роль на всех этапах заживления ран, включая гемостаз, воспаление, пролиферацию и ремоделирование . Коллаген, вырабатываемый организмами, определяется как эндогенный, который состоит из трех длинных аминокислотных цепей геликоидальной формы. Цепи полипептида, образованные повторяющейся последовательностью (Gly-X-Y), n образуют коллагены, где X и Y могут быть заняты любой аминокислотой, хотя эти позиции обычно занимают пролин и 4-гидроксипролин (Hyp, рисунок 1(b). Коллаген разрушается из-за старения, воздействия ультрафиолетового излучения и употребления табака. Разрушение коллагена приводит к появлению морщин, дряблости кожи, ригидности суставов и сухости кожи, и поэтому важно выявить новые ресурсы коллагена для регенерации тканей.

Рисунок 1

(a) Приблизительное содержание коллагена в различных тканях;(b) Структура коллагеновых волокон, фибрилл, тройных спиралей альфа-цепей и аминокислотных остатков, 4-гидроксипролина (Hyp), глицина (Gly) и пролина. Структура аминокислотных цепей коллагена (c).

Экзогенный коллаген в основном используется в пищевых продуктах, биоматериалах и фармацевтике. В связи с широким спектром применения коллагена были исследованы альтернативные источники, такие как коллаген млекопитающих крупного рогатого скота и свиней. Тем не менее, вспышка таких заболеваний, как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE), и религиозные ограничения ограничили применение коллагена на основе млекопитающих.

С другой стороны, в последние годы понятие “устойчивое развитие” стало одним из основных оплотов в рамках программ "зеленой экономики". В глобальном масштабе настоятельная необходимость перехода к экологически чистым альтернативам эксплуатации природных ресурсов была продиктована необходимостью решения растущих экологических и экономических проблем. В соответствии с этим экологическим подходом Европейская комиссия одобрила “Голубой рост”, долгосрочную стратегию, направленную на поддержку устойчивого роста в морском секторе. Согласно Карузо и др., было подсчитано, что более 50% тканей рыбы, включая плавники, головы, кожу и внутренности, выбрасываются как “отходы”, что превышает 20 миллионов тонн побочных продуктов в год. Однако использование субпродуктов из морепродуктов представляет собой растущую проблему. Более того, одной из наиболее привлекательных особенностей, характеризующих отрасль производства морепродуктов, от которой отказались, является высокое содержание ценного белка (10-25%) и соединений, богатых липидами (17-35%).

Таким образом, использование морских субпродуктов в качестве нового источника коллагена привлекает все большее внимание из-за их легкой экстракции, высокого содержания коллагена, усвояемости организмом человека с учетом его низкой молекулярной массы, биосовместимости, отсутствия рисков заболеваний животных и патогенов, экологичности, незначительного содержания биологических загрязняющих веществ и токсинов, менее значительных религиозных и этических ограничений и незначительных проблем с регулированием и контролем качества. Следовательно, многие исследования сосредоточили свои усилия на извлечении и характеристике коллагена из кожи различных рыб, таких как мелкопятнистая кошачья акула (Scyliorhinus canicula), рыба-кролик (Chimaera monstruosa), акула-фонарь (Etmopterus spp.), кошачья акула (Galeus spp.), скат-кукушка (Leucoraja naevus), обыкновенный атлантический гренадер ( Nezumia aequalis), треска (Gadus morhua), а также чешуя и плавники Catla catla и Cirrhinus mrigala.

Коллаген из кожи, костей и плавников рыб имеет низкую температуру денатурации (25-30 ° C для большинства видов рыб) по сравнению с коллагеном млекопитающих (39-40 °C) и переменный состав, что ограничивает его использование в биомедицине. Низкое содержание аминокислот (пролина и Hyp) в морском коллагене обуславливает низкую температуру денатурации, что затрудняет обращение с рыбьим коллагеном, поскольку он денатурирует при температуре тела человека. В настоящее время изучается коллаген морских беспозвоночных организмов, включая медуз и морских губок.

Основные функции коллагеновых волокон в тканях позвоночных заключаются в предотвращении преждевременного механического сбоя и содействии накоплению, рассеиванию и передаче энергии от опорно-двигательного аппарата или внешних воздействий. Коллагеновые волокна обеспечивают структурную поддержку всем органам тела и обеспечивают упругость, эластичность и прочность, необходимые для эффективного передвижения, регенерации тканей и восстановления посредством процессов механохимической трансдукции. Коллаген участвует в построении волокнистой сети клеток, называемых фибробластами, которые образуют основу для роста новых клеток. В таких областях, как дерма, коллаген играет активную роль в защите кожи, препятствуя поглощению и распространению патогенных веществ, токсинов окружающей среды, микроорганизмов и раковых клеток.

Существует несколько обзоров ресурсов коллагена для разработки биоматериалов, гидролизованного коллагена, а также источников и применений морского коллагена. Цель этой обзорной статьи - представить обновленный обзор состояния выделения коллагена из рыбных субпродуктов с особым акцентом на параметры, необходимые для выделения коллагена из рыбных субпродуктов, с использованием статей, опубликованных с января 2014 по июнь 2020 года.

2. Образование коллагена, стабильность и молекулярная структура

У позвоночных, таких как млекопитающие, рыбы и птицы, можно обнаружить 28 различных типов коллагена, которые кодируются по меньшей мере 45 различными генами. Коллаген является основным структурным белком, содержащимся во внеклеточном матриксе (ECM), на его долю приходится от 25% до 35% общего содержания белка в организме. Существует по меньшей мере 28 типов коллагена в зависимости от доменной структуры и их надструктурной организации, но 80-90% коллагена в организме состоит из типов I, II и III. Наиболее распространенный тип коллагена в организме, тип I, содержится в костях, коже, сухожилиях и органах. Тип II можно обнаружить в хрящевой ткани, а тип III - в ретикулярных волокнах, крови и коже. Коллаген III типа содержится в коже, стенках сосудов и ретикулярных волокнах легких, печени и селезенки (рисунок 1). Типы IX, XIV и XIX (FACIT: коллагены, связанные с фибриллами, с прерывистыми тройными спиралями) в небольших количествах связаны с фибриллообразующими типами, а типы IV, XIX и XVIII обнаружены в базальных мембранах клеточных мембран. Коллагены типов I-IV являются наиболее распространенными у беспозвоночных.

Одиночная молекула коллагена имеет длину около 300 нм и диаметр 1,5–2 нм, а многоколлагеновые молекулы образуют более крупные коллагеновые агрегаты, такие как фибриллы. Коллаген характеризуется структурой α-доменов с тройной спиралью, названной “тропоколлаген”, поскольку он состоит из трех различных α-цепей. Это три параллельные полипептидные нити, каждая из которых имеет конформацию левосторонней спирали, намотанной друг на друга подобно канату, образуя правостороннюю тройную спираль, или “суперспираль”, которая представляет собой общую плотно упакованную трехспиральную форму молекулы, стабилизированную множеством водородных связей. Для намотки трех левосторонних спиралей в правостороннюю тройную спираль требуется, чтобы каждая третья аминокислота представляла собой остаток глицина (Gly), в то время как многие из оставшихся позиций в цепи заполнены пролином и Hyp. Gly требуется на третьей позиции, потому что в переполненном центре трехцепочечной спирали нет места для более крупной боковой группы, чем один Н-атом Gly. Последовательность представляет собой повторяющийся паттерн X-Y-Gly, где X и Y могут быть отнесены к любым другим аминокислотным остаткам. Однако позиции X и Y часто занимают пролин и Hyp соответственно. Форма Pro–Hyp–Gly является наиболее распространенным трипептидом (10,5%) в коллагене.

Благодаря уникальной аминокислотной последовательности плотная тройная спираль коллагена особенно стабильна, и считается, что наличие Hyp в положении X способствует стабильности спирали. Гидроксильная группа Hyp играет существенную роль в стабилизации тройной спирали благодаря связыванию с пирролидиновым кольцом. Она повышает температуру денатурации и энтальпию денатурации коллагена. Более того, тройные спирали окружены сетью молекул воды, обеспечивающей термостабильность тройных спиралей благодаря высокой энтальпии денатурации, которая напрямую отражает количество водородных связей, а также функционирует как чувствительный параметр степени тройной спиральной структуры. Напротив, температура денатурации отражает энтропийный вклад в стабильность тройной спирали коллагена. Межцепочечные водородные связи стабилизируют три α-цепи в спирали и делают молекулу умеренно устойчивой к атаке других молекул. Эти водородные связи, которые возникают, когда аминогруппа (NH) остатка Gly образует пептидную связь с карбоксильными группами в соседнем полипептиде, помогают удерживать три цепи вместе.

2.1. Морской коллаген

Морские коллагены, такие как кожа рыбы, кости, хрящи и чешуя, включая источники как из морских позвоночных, так и из беспозвоночных, более биодоступны по сравнению с бычьим или свиным коллагеном и обладают более высокой способностью к всасыванию (до 1,5 раза эффективнее в организме) и более быстрой циркуляцией в кровотоке из-за их низкой молекулярной массы и малого размера частиц. Кроме того, коллагены на морской основе схожи с обычным бычьим и свиным коллагеном с точки зрения аминокислотного состава и биосовместимости. Рыбий коллаген может быть получен из различных рыбных побочных продуктов, таких как рыбные кости, чешуя и шкуры (рисунок 2а), которые ежедневно потребляются в разных частях мира и приводят к образованию большого количества отходов - от 50% до 70% исходного сырья, которое образуется в рыбных цехах и на перерабатывающих фабриках.

Рисунок 2

(a) Рыбьи кости, чешуя и кожа как источники коллагена. (b). Процедура извлечения коллагена из рыбных субпродуктов.

2.1.1. Рыбья кожа

Кожа рыбы обычно содержит коллаген I типа с высокой степенью чистоты (около 70%) в зависимости от возраста вида и сезона года. Коллаген из рыбьей кожи демонстрирует превосходную способность удерживать воду (около 6% от его веса при воздействии 63% влажности в течение 24 часов) и не оказывает раздражающего действия, поэтому подходит для нанесения на кожу. Исследование Бланко и др. коллагена из кожи двух видов костистых и двух видов хрящевых показало температуру денатурации коллагена в диапазоне от 23 до 33 ° C, в то время как коллаген, выделенный из кожи трески, денатурировался при температуре около 16 ° C, что, возможно, могло быть связано со средой обитания вида. Однако коллаген из кожи тилапии, сома, помфрета и макрели требует низкой температуры экстракции (чуть ниже 13,26 °C), длительного времени экстракции (74 ч) и дает выход 2,27% (в пересчете на содержание сухой массы). В другой работе Виджая и др. исследовали аллергенные свойства коллагена из кожи рыбы Паранг-Паранг. Выделение коллагена проводили с использованием 0,1 М NaOH в течение 12 ч, а перед экспериментом его гидролизовали с использованием 0,5 М уксусной кислоты (AcOH). Содержание неколлагенового белка составило 0,2163 мг/мл при выходе 1,915%. Говиндхарадж и др. исследовали использование коллагена, полученного из кожи угря (тип I), для приложений 3D-печати. Конечный выход коллагена составил около 4,2%. Сообщалось о аналогичном результате, при котором выход коллагена, извлеченного из рыбы-угря, составил 4,7% . Ахмед и др. исследовали использование бактериальных коллагенолитических протеаз (CP) для извлечения коллагена из кожи рыб в качестве альтернативного метода. Для производства CP они использовали две бактерии, Bacillus cereus FORC005 и Bacillus cereus FRCY9-2. Общий выход коллагена при обработке бактериями и в сочетании с кислоторастворимым коллагеном составил 188 и 177 г/ кг соответственно, что было больше, чем выход только при кислотной экстракции (134,5 г/ кг). Другим подходом к извлечению коллагена из кожи рыбы является использование воды, подкисленной CO2, которая использовалась для выделения коллагена из атлантической трески (Gadus morhua). Общее содержание пролиноподобных аминокислот в коллагене, экстрагированном подкисленной водой, составило 151/1000 остатков, с выходом экстракции 13,8% (по массе).

2.1.2. Рыбья чешуя Рыбья чешуя составляет значительное количество отходов рыбоперерабатывающей промышленности. Недавние исследования показали, что коллаген, полученный из рыбьей чешуи, обладает свойствами, типичными для коллагена I типа, состоящего из двух α1-цепей и одной α2-цепи. Исследование коллагена из чешуи тилапии (Oreochromis sp.) показало высокую температуру денатурации (57,9–79,0 ° C), что, возможно, связано с его высоким содержанием аминокислот и более высокими внутри– / межцепочечными связями (водородные связи, диполь-дипольные связи, ионные связи и ван-дер-ваальсовы взаимодействия). Напротив, коллаген, выделенный из чешуи свежего карпа (Cyprinus carpio), показал низкую температуру денатурации (32 °C). Коллаген из чешуи тилапии, сома, помфрета и макрели требует более высокой температуры экстракции (диапазон 16,6–19,03 °C) и более длительного времени экстракции (77,51 ч) с более низким выходом экстракции (0,13%) по сравнению с кожей рыбы (4,3%). Коллаген из рыбьей чешуи также обладает надлежащими свойствами водопоглощения (13,3%) и удерживания (15%), что делает его пригодным для медицинского и терапевтического применения. Раневая повязка на основе коллагена (паста и лист) из чешуи тилапии и серой кефали продемонстрировала отличную антимикробную активность против золотистого стафилококка и кишечной палочки методом дисковой диффузии. Более того, раневая повязка обладала высокой способностью закрывать раны (до 99,63%), что указывает на роль коллагена рыбьей чешуи в ускорении реэпителизации. Однако из-за высокого содержания кальция (16-59% от массы минерала) в рыбьей чешуе декальцинацию необходимо проводить с помощью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

2.1.3. Рыбьи кости Коллаген из рыбьей кости обладает свойствами коллагена I типа, состоящего из двух цепей α1 и одной цепи α2. Исследование коллагена из костей тилапии (Oreochromis mossambicus) показало температуру денатурации 32,5 °C. Коллаген из рыбьих костей тилапии, сома, помфрета и скумбрии требует высокой температуры экстракции (16,6–19,03 ° C) и меньшей продолжительности экстракции (73,16 ч) по сравнению с рыбьей чешуей и кожей, а также имеет более низкий выход экстракции (0,64%) по сравнению с рыбьей кожей . Рамли и др. сообщили, что коллаген из кости Lutjanus sp. с выходом 4,535% (при концентрации белка 8,815 мг / мл) может быть использован в качестве природного противоопухолевого средства. Высокоинтенсивные импульсные электрические поля (PEF) являются одним из основных подходов к извлечению коллагена из рыбьей кости. В исследовании, проведенном Им и его коллегами, для выделения кальция, хондроитина и коллагена из отходов рыбьих костей применялся комбинированный метод полубионной экстракции (SBE) и PEF-обработок. В методе SBE процесс переваривания и всасывания в желудочно-кишечном тракте человека моделируется посредством повторяющейся кислотной и щелочной экстракции в различных диапазонах рН. Используя PEF 22,79 кВ/см, авторы извлекли 3,87 мг / мл коллагена, а комбинированный метод PEF и SBE был признан эффективным для выделения коллагена, кальция и хондроитина из рыбьей кости.

Та же группа в недавнем исследовании достигла максимального выхода коллагена в 16,13 мг / мл из рыбьих костей с использованием 1% пепсина при прочности PEF 20 кВ / см. Обессоливание также предлагается в качестве важного процесса при извлечении костного коллагена из-за высокого содержания в нем гидроксиапатита и кальция, которые удаляются EDTA или HCl во время предварительной обработки; однако использование HCl может привести к разрушению коллагена.

2.1.4. Рыбий хрящ Коллаген из рыбьего хряща состоит преимущественно из коллагена II типа и некоторых других типов коллагена в незначительных количествах, таких как тип IX и тип XI, обнаруженных в носовом хряще хоки (Macruronus novaezelandiae). Коллаген I типа содержится в хрящах Sphyrna lewini, Dasyatis akjei и Raja porosa. В хрящевой ткани амурского осетра (Acipenser schrenckii) коллаген I типа был обнаружен в солюбилизированном кислотой и солями коллагене, а тип II с другими второстепенными типами был обнаружен в солюбилизированном пепсином коллагене. Сообщалось, что коллагены, полученные из хряща Хоки, имеют сходный набор α-цепей, аминокислотный состав и структуру с коллагенами в хряще млекопитающих; и они могут иметь потенциал в качестве биоматериалов для лечения заболеваний, связанных с хрящом. Физико-химические и антиоксидантные свойства коллагена, выделенного из серебристой акулы (Carcharhinus albimarginatus), были оценены Jeevithan et al. Из этого хряща были извлечены кислоторастворимый коллаген II типа (ASC), солюбилизированный пепсином коллаген (PSC) и желатин II типа. Температура денатурации желатина II типа составила 32,5 °C, что выше, чем у двух других коллагенов (PSC и желатина II типа). Однако антиоксидантная активность в отношении 1,1-дифенил-2-пикрилгидразильных радикалов и восстанавливающая способность PSC были выше, чем у ASC II типа и желатина II типа. Коллагены, выделенные из серебристой акулы, могут быть подходящим кандидатом для биомедицинского применения благодаря их более высокой антиоксидантной активности. В другом исследовании Luo и соавт. [61] получили ASC и PSC из хрящей сибирского осетра (Acipenser baerii) с выходом 27,13 ± 1,15% и 14,69 ± 0,85% соответственно. Согласно результатам, коллагены из этого хряща могут быть подходящей альтернативой коллагенам млекопитающих II типа.

Коллаген рыбьего хряща имеет более низкую температуру денатурации, чем бычий коллаген, в диапазоне от 26,3 ° C до 35,9 ° C, что связано со средой обитания вида; например, низкая температура денатурации коллагена hoki collagen соответствует среде обитания в холодной воде. Альтернативно, коллаген кеты (Oncorhynchus keta) денатурируется при 19 °C, в то время как коллаген акулы денатурируется при температуре около 30 °C. Такая температурная нестабильность ограничивает применение некоторых биоматериалов, полученных из коллагена, в медицине человека. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы найти столь же устойчивую альтернативу рыбьему коллагену с более высокой температурой денатурации, которая более удобна для биомедицинских применений и могла бы гарантировать лучшие характеристики с точки зрения термической и механической стабильности. Помимо термической стабильности, состав / структура коллагена должна быть максимально схожа с коллагенами млекопитающих, особенно для биомедицинских применений.

3. Методы извлечения коллагена

На основе морских источников могут быть использованы различные методы извлечения. Однако общая процедура выделения коллагена включает подготовку, экстракцию и извлечение (рисунок 2 b).

Приготовление в основном состоит из промывания, очистки, отделения частей животного происхождения и уменьшения размера путем разрезания или измельчения образцов для облегчения последующей предварительной обработки образцов. После получения препарата проводится мягкая химическая предварительная обработка для повышения эффективности экстракции и удаления неколлагенистых веществ. Как правило, в зависимости от сырья и метода экстракции могут проводиться различные предварительные обработки (щелочная или кислотная). Предварительная обработка используется разбавленной кислотой или основанием для разрушения сшитого коллагена перед экстракцией из-за наличия сшитого коллагена в соединительной ткани животных. Действительно, происходит частичный гидролиз, который сохраняет цепи коллагена неповрежденными.

При кислотной форме предварительной обработки сырье погружают в раствор кислоты. Проникающий раствор в структуру коллагена позволяет ему набухать в два или три раза по сравнению с первоначальным объемом, что приводит к разрыву нековалентных межмолекулярных и внутримолекулярных связей. Предварительная щелочная обработка в основном выполняется с использованием гидроксида натрия (NaOH) и гидроксида кальция (Ca(OH)₂) в течение периода, который может занять от нескольких дней до нескольких недель. Однако использование NaOH более удобно из-за более высокой способности к набуханию, что облегчает извлечение коллагена за счет увеличения скорости переноса массы в тканевой матрикс.

Более того, перед этапом экстракции требуется деминерализация сырья для повышения эффективности извлечения коллагена из частей тела с высоким содержанием минералов, таких как кости, хрящи и чешуя. Обычно деминерализацию можно выполнить с использованием либо EDTA, либо HCl.

Коллагеновые волокна представляют собой тройную спираль со стабильными межмолекулярными и внутримолекулярными водородными связями, которые делают коллагеновые волокна нерастворимыми в воде. Следовательно, для экстракции требуется использование специальных методов экстракции, чтобы увеличить солюбилизацию коллагеновых белков и завершить их выделение. Экстракция солюбилизированного кислотой коллагена (ASC), экстракция солюбилизированного пепсином коллагена (PSC), экстракция глубоким эвтектическим растворителем (DES) и экстракция сверхкритической жидкостью (SF) являются основными методами, описанными в литературе для выделения коллагена из рыбных субпродуктов.

3.1. Процедура кислотной экстракции

ASC известен тем, что коллаген извлекается только кислотой. Кислоты (такие как HCl и AcOH) гидролизуют тройную спираль коллагена и солюбилизируют его отдельные цепи в растворе, где происходит деполимеризация тяжелых белков в более короткие пептиды (0,3–8 кДа). Взаимодействие кислоты с молекулами коллагена разрушает поперечные связи, присутствующие в коллагеновой спирали, и повышает эффективность извлечения. Поэтому представляет большой интерес исследовать эффективность экстракции с использованием различных кислот для максимального повышения чистоты и выхода экстрагируемого коллагена. Расщепление тройной спирали, осуществляемое кислотами, схематично показано на рисунке 4.

AcOH является одним из наиболее распространенных соединений, с помощью которых осуществляется извлечение коллагена из животных и морских источников. Диапазон концентраций кислотного экстракционного раствора составляет от 0,5 до 1 Мкл, что позволяет расщеплять внутри- и межмолекулярные поперечные связи, не влияя на структуру коллагеновых цепей. Хотя в большинстве исследований исследователи используют 0,1 или 0,5 М AcOH для извлечения коллагена из кожи рыб, Тан и соавт. исследовали эффект использования различных кислот (AcOH, соляная кислота, лимонная кислота и молочная кислота, W: V = 1: 50), соотношений жидкости и твердого вещества и различного pH (1.8, 2.1, 2.4, 2.7 и 3.0) об извлечении коллагена из кожи сома различными методами (кислотными, с использованием гомогенизации и пепсиновых методов экстракции). Метод с использованием пепсина и гомогенизации (PHSC) показал самое высокое извлечение белка (64,19% при рН 2,4 в пересчете на HCl). Что касается метода кислотной экстракции, то скорость извлечения белка, выделенного из кожи с помощью HCl при рН 2,4, составила 42,36% (самый высокий показатель), за которым следует экстракция с рН 2,7 AcOH (39,45%). Это исследование противоречило другим исследованиям, в которых сообщалось о более низком выходе экстракции коллагена HCl по сравнению с AcOH. Причина может быть в различных концентрациях используемой кислоты, а также в том, что рН смеси не поддерживался на начальном уровне, который имел тенденцию меняться со временем экстракции.

Влияние AcOH в диапазоне 0,2–1,0 Мкм на извлечение коллагена из кожи подошвы рыбы было определено Arumugam et al., в то время как остальные переменные были постоянными. Выход коллагена постепенно увеличивался с увеличением концентрации AcOH, так что максимальный выход составил 15,968 мг/ г при 0,6 М AcOH. Однако при превышении 0,6 М выход коллагена снижался.

Янг и др. изучали взаимодействие между молекулами коллагена и раствором AcOH. Агрегированное состояние молекул коллагена и концентрация AcOH были связаны друг с другом таким образом, что критическая концентрация агрегации коллагена увеличилась с 0,518 до 1,581 мг/ мл при изменении концентрации AcOH с 0,1 до 2,0 Мг/мл. Было исследовано реологическое поведение раствора коллагена в зависимости от концентрации AcOH, чтобы понять взаимодействие между молекулами коллагена и кислотным растворителем. Все образцы показали поведение при истончении при постоянном сдвиге, которые могут быть использованы в качестве биоинъекций для 3D-печати. С увеличением концентрации AcOH повышалась способность коллагена к текучести, что могло быть связано с уменьшением вязкости. В дополнение к AcOH для извлечения коллагена использовались лимонная и молочная кислоты.

3.2. Процедура извлечения AcOH с помощью пепсина

Экстракция AcOH пепсином является вторым основным методом извлечения коллагена, который позволяет расщеплять телопептидные участки тройной спирали, облегчая выщелачивание коллагеновых пептидов в растворе и увеличивая выход экстракции. PSC - это известный пепсин, который добавляют в процесс экстракции (рисунок 3). Поэтому во многих исследованиях использовалась предварительная ферментативная обработка с использованием пепсина для расщепления телопептидных концов коллагеновых цепей, чтобы облегчить удаление белков из оставшегося матрикса. Несколько факторов играют решающую роль в эффективности методов экстракции AcOH с использованием пепсина, таких как концентрация пепсина, время гидролиза и соотношение твердое/ жидкое (S / L) в коллагене, солюбилизированном пепсином, которые необходимо оптимизировать для получения более ценных результатов. Влияние концентрации пепсина на выход экстракции растворимого в пепсине коллагена исследовали при неизменных других параметрах экстракции. Увеличение концентрации пепсина (с 800 до 1200 Ед/г) привело к впечатляющему увеличению выхода выделения (с 66,35% до 79,93).

Рисунок 3

Разница между методами извлечения кислоторастворимого коллагена (ASC) и пепсинорастворимого коллагена (PSC).

Более того, Джунианто и соавт. исследовали влияние концентрации как AcOH, так и фермента пепсина при выделении коллагена из кожи рыбы нилем. Для этой цели они использовали три различные концентрации AcOH и фермента пепсина. Результаты показали, что максимальный выход экстракции коллагена (6,18%) был получен при комбинированной обработке концентрации 0,7 М раствора AcOH ферментом пепсином в 1,0%.

В целом, гипоаллергенная диета может быть эффективным способом справиться с аллергическими реакциями на пищевые продукты. Она требует сознательного и осознанного подхода к питанию, но может принести значительные пользы в виде снижения симптомов аллергии и улучшения общего самочувствия.

Основные принципы гипоаллергенной диеты заключаются в исключении или существенном снижении потенциально аллергенных продуктов из рациона питания. Прежде всего, это относится к таким широко распространенным аллергенам, как молоко и молочные продукты, яйца, пшеница, соя, орехи, рыба и морепродукты. Кроме того, некоторые фрукты и овощи также могут вызывать аллергические реакции у отдельных людей.

Гипоаллергенная диета предлагает не только ограничение определенных продуктов, но и возможность найти заменители. В пищевой индустрии существует множество альтернативных продуктов, которые могут быть приемлемы для людей, следующих гипоаллергенной диете. Например, соевое молоко или пророщенная киноа могут использоваться вместо обычного молока или пшеничных продуктов. Эти заменители позволяют обеспечить необходимые питательные вещества и одновременно избегать аллергенов.

При составлении гипоаллергенного рациона следует обратить внимание на надлежащую разнообразность продуктов, чтобы избежать дефицита каких-либо важных питательных компонентов. Рекомендуется обратиться к врачу или диетологу, чтобы получить индивидуальные рекомендации и разработать наиболее оптимальный план питания, учитывая особенности и потребности организма.

Гипоаллергенная диета представляет собой эффективное лечебное и профилактическое средство для организма людей, страдающих от аллергических реакций на определенные продукты. Это комплексное подход, основанный на принципах исключения или снижения потенциально аллергенных компонентов, выборе высококачественных продуктов и обеспечении сбалансированного рациона. Последование указанным правилам и рекомендациям гипоаллергенной диеты способствует значительному улучшению качества жизни и снижению риска возникновения аллергических реакций. Данный подход рекомендуется как докторами, так и специалистами по питанию для достижения оптимального здоровья и благополучия пациентов.

Механизмы действия пробиотиков на организм

Пробиотики – это микроорганизмы, которые способны положительно влиять на состояние организма. Они обычно представляют собой живые бактерии или дрожжи, которые при употреблении в достаточном количестве могут оказывать благоприятное воздействие на пищеварительную систему и иммунную систему.

Механизмы действия пробиотиков на организм многогранны и до конца не изучены. Во-первых, пробиотики способны улучшить работу пищеварительной системы. Они помогают разложить пищу и усваивать полезные вещества, такие как витамины и минералы. Также они способствуют нормализации микрофлоры кишечника, что может привести к лучшему обмену веществ и укреплению иммунитета.

Кроме того, пробиотики могут оказывать прямое воздействие на иммунную систему. Они стимулируют производство защитных антител и других компонентов, ответственных за борьбу с инфекциями. Это особенно важно для поддержания здоровья при регулярном употреблении антибиотиков, которые могут негативно сказываться на микрофлоре кишечника

Пробиотики и здоровье кишечника: влияние на микробиоту и пищеварение

Пробиотики - это живые микроорганизмы, которые при употреблении в достаточном количестве оказывают положительное влияние на здоровье человека. Одной из главных областей их действия является кишечник.

Микробиота – это совокупность микроорганизмов, которые обитают в кишечнике. Она играет ключевую роль в поддержании иммунитета, пищеварении и абсорбции питательных веществ. Пробиотические бактерии помогают поддерживать баланс между "хорошими" и "плохими" микроорганизмами в кишечнике, что способствует нормализации функций органа.

Пробиотические бактерии также способствуют лучшему перевариванию пищи и усвоению питательных веществ. Они помогают разлагать сложные соединения, которые организм не может переработать самостоятельно. Также присутствие пробиотиков стимулирует выработку ферментов, необходимых для расщепления пищевых компонентов.

Благодаря своему влиянию на микробиоту и пищеварение, пробиотики могут помочь справиться с различными проблемами, такими как запоры, дисбактериоз, синдром раздраженного кишечника и другие расстройства желудочно-кишечного тракта

Влияние пробиотиков на иммунную систему и общее состояние организма

Пробиотики являются живыми микроорганизмами, которые положительно влияют на здоровье человека. Они способны оказывать значительное влияние на иммунную систему и общее состояние организма.

Пробиотические бактерии помогают укрепить иммунитет, делая его более эффективным в борьбе с инфекциями и другими патогенными микроорганизмами. Они активизируют процессы фагоцитоза - поглощения и уничтожения вредных для организма клеток. Пробиотики также способствуют повышению уровня антиоксидантов, которые защищают клетки от повреждений свободными радикалами.

Употребление пробиотиков может снижать риск развития аллергических реакций и автоиммунных заболеваний, так как они помогают поддерживать нормальный баланс между «дружественными» и «враждебными» бактериями в кишечнике. К тому же, пробиотические бактерии способны синтезировать витамины группы В, которые необходимы для нормального функционирования иммунной системы.

Кроме того, пробиотики могут оказывать положительное влияние на общее состояние организма

Применение пробиотиков в медицине и практические рекомендации по их использованию

Применение пробиотиков в медицине становится все более популярным, поскольку их положительное влияние на организм было доказано многими исследованиями. Пробиотики помогают поддерживать здоровую микрофлору кишечника, укреплять иммунную систему и снижать риск развития некоторых заболеваний.

Они используются для лечения дисбактериоза, синдрома раздраженного кишечника, аллергических реакций и других желудочно-кишечных проблем. Пробиотические добавки также могут быть полезны после приема антибиотиков, чтобы восстановить баланс микрофлоры.

При использовании пробиотиков следует обратить внимание на выбор правильной формы (капсулы, порошок или жидкость) и правильную дозировку. Рекомендации по использованию пробиотиков обычно зависят от конкретной ситуации и индивидуальных особенностей пациента.

Важно помнить, что пробиотические добавки не являются панацеей и не должны заменять сбалансированное питание и здоровый образ жизни. Перед началом приема пробиотиков рекомендуется проконсультироваться с врачом, чтобы получить индивидуальные рекомендации и избежать возможных побочных эффектов.

Введение в проблему: значимость иммунитета для здоровья человека

Иммунитет – это сложная система организма, отвечающая за защиту от вредных микроорганизмов, инфекций и других патогенных факторов. Он играет важную роль в поддержании здоровья человека и предотвращении развития многих заболеваний. Понимание значимости иммунитета становится все более актуальным в нашей современной жизни, где мы постоянно подвергаемся стрессу, плохому питанию и неблагоприятной экологии.

К сожалению, снижение иммунитета является распространенной проблемой. Это может происходить из-за различных причин, таких как недостаток важных питательных веществ, хронический стресс или нарушение деятельности иммунной системы. В результате организм становится более уязвимым для инфекций и других заболеваний.

Однако есть несколько методов, которые помогут укрепить иммунитет. Правильное питание является одним из ключевых аспектов поддержания здорового иммунного ответа. Витамины (в особенности витамин С и D), минералы, антиоксиданты и другие питательные вещества играют важную роль в функционировании иммунной системы.

Также физическая активность способствует укреплению иммунитета

Факторы, влияющие на иммунитет: генетика, образ жизни, питание

Факторы, влияющие на иммунитет, являются ключевыми для поддержания здоровья организма. Генетика играет важнейшую роль в определении уровня иммунитета у каждого человека. Некоторые люди могут быть более предрасположены к снижению иммунной защиты из-за наследственных факторов.

Образ жизни также оказывает значительное влияние на иммунитет. Регулярная физическая активность и достаточный отдых способствуют укреплению иммунной системы. Напротив, недостаток сна и хронический стресс могут негативно повлиять на функционирование иммунной системы.

Правильное питание является еще одним фактором, который необходимо учитывать при поднятии иммунитета. Включение в рацион пищи, богатой антиоксидантами (фрукты, овощи), полезными жирами (рыба, орехи) и витаминами (цитрусовые, зелень), поможет укрепить защитные свойства организма.

В целом, генетика, образ жизни и питание взаимосвязаны и влияют на иммунитет. Понимание этих факторов поможет каждому человеку принять меры для укрепления своей иммунной системы и поднятия ее уровня.

Тренировка иммунной системы: физическая активность и спорт

Физическая активность и спорт играют важную роль в поднятии иммунитета. Научные исследования показывают, что регулярная физическая тренировка может улучшить функцию иммунной системы и снизить риск развития инфекций.

Одним из механизмов, через которые физическая активность повышает иммунитет, является усиление циркуляции лимфоцитов - клеток, отвечающих за борьбу с инфекциями. Также тренировка способствует улучшению кровообращения и повышению тонуса сердечно-сосудистой системы, что способствует быстрому распределению антител по организму.

Спортивные занятия также способствуют выработке эндорфинов - гормонов радости и благополучия. Они помогают справиться со стрессом и укрепляют психологическое состояние организма. У людей, занимающихся спортом, обнаруживается более стойкое положительное настроение и меньший уровень депрессии.

Однако следует помнить, что избыточная физическая нагрузка может ослабить иммунную систему. Поэтому важно соблюдать правильный баланс между тренировками и отдыхом

Правильное питание для поддержания иммунитета: витамины и минералы

Правильное питание играет важную роль в поддержании и укреплении иммунной системы. Организму требуется определенный набор витаминов и минералов для борьбы с инфекциями и заболеваниями. Витамин С является одним из самых важных антиоксидантов, который помогает повысить активность иммунных клеток и защищает организм от свободных радикалов. Его можно получить из цитрусововых фруктов, киви, перца, клубники и других плодов. Витамин D также имеет прямое воздействие на иммунную систему, способствуя производству антибактериальных пептидов. Его можно получить из жирной рыбы, яичного желтка и обогащенных продуктов. Цинк играет ключевую роль в развитии и функционировании иммунных клеток. Добавление гречки, орехов, моллюсков и темного шоколада в рацион может помочь укрепить иммунную систему. Кроме того, необходимо обеспечить достаточное потребление других полезных элементов питания, таких как железо, медь и селен. Важно помнить, что правильное питание должно быть частью общего здорового образа жизни, включая достаточную физическую активность и умеренное потребление алкоголя и табака

Иммуномодуляторы и другие методы укрепления иммунитета: современные достижения и перспективы

Иммуномодуляторы являются одним из самых эффективных способов укрепления иммунитета. Эти вещества воздействуют на различные компоненты иммунной системы, стимулируя их активность и повышая сопротивляемость организма к инфекционным заболеваниям. Среди наиболее распространенных иммуномодуляторов можно выделить препараты на основе гамма-интерферона, интерлейкина-2 и других цитокинов.

Однако, помимо иммуномодуляторов, существуют и другие методы укрепления иммунитета. Один из них – правильное питание. Витамины (особенно витамин С, D и E), минералы (цинк, железо) и антиоксиданты (каротиноиды, полифенолы) играют ключевую роль в поддержании здоровой иммунной системы. Поэтому рацион должен быть богат фруктами, овощами, ягодами, орехами и зелеными овощами.

Также важную роль играет физическая активность. Регулярные тренировки способствуют улучшению кровообращения и обмена веществ, а также активизируют работу иммунной системы. Однако, следует помнить о мере, так как чрезмерные нагрузки могут ослабить иммунитет.

Другим методом укрепления иммунитета является соблюдение гигиены.