ПЦР: как это делается. Часть 1⁠⁠

ПЦР (полимеразная цепная реакция). Он же ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція). Он же PCR (polymerase chain reaction).

В общем, я достаточно долго собиралась написать этот пост. В связи с тем, что за последний год только очень ленивый не запомнил эти три буквы (хотя не факт, что знает, что это и почему); а я ПЦРы в последнее время делаю постоянно - хотела показать, как это работает с «живыми» картинками.

Сразу оговорюсь:

- пробы у меня не опасные и не очень чувствительные ко всяким посторонним факторам, поэтому многие вещи можно делать на "обычном" лабораторном столе, а не в вытяжном шкафу, в полной униформе, с фильтрацией всего на свете и бунзеновской горелкой под боком :D

В общем, могут получаться нормальные фото.

- с тех пор как Кэри Муллис первый раз проводил такой тест в далеком 1983-ем, появилось много разных и все более автоматизированных его подвидов, где «вживую» видно все меньше и меньше, на экране ПК все больше и больше. Я показываю достаточно классический, «ручной» и наглядный вариант. Но когда-нибудь нас, конечно же, захватят роботы и все такое. Кому интересно дальше - в Ютубе миллион всяких видео, конечно же.

Подписи и комментарии ПОД фото.

Итак, начать мне придется с одной картинки из интернета - это принцип работы ПЦР в целом. Сюжет такой: мы берем ДНК, вспоминаем, что она – двойная цепочка, разделяем их, строим к каждой половине пару и получаем из одной ДНК уже две ее точных копии. На следующем шаге располовиниваем обе свеженькие копии ДНК, достраиваем к каждой из частей вторую половинку и получаем уже 4 одинаковые копии исходной молекулы и повторяем этот процесс раз этак 30-40. В итоге получаем из одной исходной ДНК 2^30 ДНК (=1073741824=больше миллиарда копий).

Все это мы делаем, обеспечив нашей ДНК уютную среду обитания (буферную жидкость), «кирпичики» строительного материала ДНК (нуклеотиды, обозначаются буквами A, T, G, C), копировальную машинку (полимеразу) и специфичные ПРАЙМЕРЫ (схематичные малиновые штучки на картинке. Вживую они примерно 20 нуклеотидов в длину, что дает одну на более чем триллион специфичную комбинацию (это 12 нулей)). Праймеры нужны для того, чтобы копирование вообще началось, т.к. копировальной машинке надо за что-то зацепиться. И чтобы копии делались только с очень определенного места, если оно, конечно же, вообще есть в нашей пробе.

Зачем это все нужно? Затем, что у любого анализа есть порог чувствительности и погрешности, ДНК очень маленькие и чем их больше, тем точнее и нагляднее результат.

Тут еще важно сказать – если в пробе нет подходящей последовательности, т.е. изначально подходящих кусочков 0 – то после 30-ти циклов будет 0^30 копий – т.е. все еще НОЛЬ и тест покажет зияющую пустоту.

На этом заканчиваем с чужими картинками :)

Моим друзьям программистам может многое объяснить вот это фото. По сути мы просто нагреваем и охлаждаем нашу смесь до нужных для каждого этапа благоприятных температур по кругу (в данной программе даже 40 раз, создавая даже 2^40 копий ДНК).

Кэри Мюллис в свое время делал это вручную, 2-3 часа подряд окуная пробирку в воду разной температуры каждые 30 секунд, наверняка обложенный миллионом таймеров, термометров, нагревателей, охладителей и протоколов. Можно только посочувствовать.

Сейчас этим всем занимается машина размером с принтер, задача человека «только» намешать нужную смесь, рассчитать и вбить нужную программу, и тд.

Пробы. Пока что это просто кусочки ткани. Может быть и кровь, в принципе, итд.

Путем некоторой (крайне ненаглядной со стороны) подготовки ДНК из них переместится в прозрачную для глаза человека жидкость.

Объём пробирки на фото - 1,5 мл.

Пробы надо внимательно сортировать и подписывать. В больших лабораториях, куда попадают ваши пробы все это уже автоматизируется, клеятся уникальные штрих-коды в духе тех, что вы могли видеть на пробирках для крови и тд. Но по большому счету принцип тот же – все должно быть четко пронумеровано, подписано и запротоколировано (несколько раз).

Затем для каждого ПЦР готовится нужный «суп» из всех упомянутых ингредиентов. Цвет его не принципиален, тут у нас просто буферная жидкость была розовая (чему я всегда безумно рада, потому что человеку с цветной жидкостью работать удобнее, чем с прозрачной, честно-честно)

«Суп» разливается по специальным ПЦР-тубам и в каждую добавляется немного растворенной, концентрированной и хорошо перемешанной пробы - специфично для каждого теста, типа пробы и тд.

Тут вы видите в наконечнике 1 МИКРОлитр жидкости (1/1000 миллилитра).

Это мало, да. Но реактивы – вещь дорогая, а этого достаточно – увидим в конце второго поста.

Если вам интересно, что это за выцветающая фиолетово-розовая штука – это охлажденный блок, который меняет цвет в зависимости от температуры. Дело в том, что полимераза («копировальная машинка») очень чувствительна к перепадам температуры и мы не хотим, чтобы с ней случилось что-то не то на этапе подготовки.

По итогу в каждой ПЦР-тубе оказывется 50 МИКРОлитров смеси «супа» и пробы (1/20 миллилитра, всего в ПЦР-тубу мжет под завязку поместиться 0,2 миллилитра).

*Из забавного - тут очень пригождается навык сбивания ртутных и спиртовых градусников – разлитые по тубам (и закрытые крышкой!) пробы нужно встряхнуть одним старым-добрым четким движением руки - чтобы избавиться от пузырьков воздуха, которые могли остаться в жидкости и могут испортить все дело. При этом жидкость не размажется по стенкам и крышкам, а останется вся внизу. Ну если сбивать «правильно». У (очень молодых) людей, которые всю жизнь пользовались уже электронными термометрами, с этим этапом часто большие проблемы)))).

Все это дело отправляется в нашу запрограммированную нагревательно-охладительную машину. Естественно, мы все подписали и запротоколировали несколько раз. И ушли ждать конца программы.

*Из забавного - на тубах стало еще меньше места, поэтому биологу внезапно оказывается очень полезен навык письма очень маленькими символами. Но все равно приходится упрощать нумерацию до минимума и записывать в протоколах, что под номером 1 в программе, запущенной 15.01.21 в 18:43 на 5ой машине находилась проба номер 5462368479 из проекта jgdfjvb_gyrgfhsd_2А.

Что будет дальше, пожалуй, напишу вторым постом, и так много. Мы пока на середине процесса.