Выделение нематод из корней заражённых растений⁠⁠

Написал в одном из комментариев, что работаю с нематодами и под ним попросили сделать об этом пост. На меня неожиданно подписалось 45 человек, и один даже запомнил, зачем:

Ладно, не отвертишься, пришлось делать. Работать будем с этими ребятами:

Сразу приведу название публикации, протокол из которой использовал: "Assessing Attraction of Nematodes to Host Roots Using Pluronic Gel Medium".

Как раз прошло достаточно времени с тех пор, как высадил растения в зараженную почву (около месяца).

Если очистить корни растений, то можно обнаружить узелки, или галлы - именно здесь паразитируют наши нематоды. У нематод есть твёрдый и острый стилет, при помощи которого они могут проникать внутрь молодых отростков корней и передвигаться внутри корня. Оказавшись в подходящей локации внутри корня, нематоды синтезируют определённые ферменты и факторы, провоцирующие активный рост клеток (обычно растут 4 клетки), но при этом блокируют механизмы деления клеток. В итоге образуются так называемые гигантские клетки, которые мы и можем разглядеть в виде узелков.

Не очень хорошо очистил корни, так как не хочу смыть яйца нематод с поверхности узелков.

Далее необходимо порезать корни на куски поменьше. На фото я уже поместил их в сито.

Ну а теперь нужно подготовить 2 сито с сечением поменьше - номер 200 (сечение 75 мкм) и 500 (25 мкм). Яйца нематод, с которыми я работаю, примерно 90 мкм в длину и 45 мкм в диаметре, так что при промывании корней водой они легко пройдут через сито 200 и останутся на сито 500.

Корни заливаются сначала 0.6% раствором хлорки, и активно "трясутся" для того, чтобы яйца отцепились от узелков. Сами нематоды живут внутри узелков, но яйца откладывают на их поверхность. После промываются обычной водой.

Я предпочитаю трясти зачёркнуто(яйцами) корнями в пластиковом сито и сливать воду на другие сито, чем делать это сразу на номере 200, как предлагают в протоколе:

После хорошей промывки убираем верхнее сито и видим фракцию всего вымытого размером от 25 до 75 мкм, которую мы аккуратно собираем

Подбираем баланс и центрифугируем при скорости 1400 g 5 минут

Далее вся жидкость сливается, остаётся только грязный осадок, который смешивается с 36% раствором сахарозы, сверху доливается пара милилитров воды, и все это опять сентрифугируется 5 минут но уже при скорости 330 g

При такой скорости все тяжёлые примеси уйдут на дно, а более лёгкие яйца нематод вытеснятся 36% сахарозой в воду на поверхности, которую мне и надо собрать

Далее вода с яйцами нематод промываются 0.6 % хлоркой и потом водой три раза. Получаем такой осадок с яйцами

После этого готовим ёмкость с ситом, в ёмкость наливается вода таким образом, что бы её поверхность была чуть выше, чем само сито, и на сито укладывается пара салфеток

На салфетки мы и выливаем жидкость с яйцами нематод. Закрываем и подписываем, так как все, что оставлено в лаборатории и не подписано, будет уничтожено лаборантом

Оставляем в таком виде на три дня, нематоды вылупятся из яиц и залягут на дно до лучших времен. Приложу картинку с прошлой эстракции

Уот так уот. Зачем я их выделял? В дальнейшем я буду выделять их них ДНК, готовить 16S библиотеку, секвенировать и анализировать микробиом.