Главный герой сериала — Питер Паркер, который ведёт двойную жизнь. С одной стороны, он студент университета Empire State University и внештатный фотограф издания The Daily Bugle, а с другой — супергерой Человек-паук, который борется с преступностью, скрывая свою личность. Джей Джона Джеймсон, редактор The Daily Bugle, не доверяет Человеку-пауку, но при этом платит Паркеру за фотографии этого супергероя и даже взял на работу в редакцию, не подозревая, что Паркер по сути снимает сам себя.
Питер Паркер по сюжету является сиротой и живёт под опекой тёти Мэй. Дядя Питера, Бен Паркер, был убит вне рамок сюжета сериала. Из сокурсников по университету дружит с Гарри Озборном — сыном Нормана Озборна, влиятельного промышленника и главы компании Oscorp. Несмотря на свою двойную жизнь, Питер в течение сериала имел романтические отношения сначала с Фелицией Харди, а позже с Мэри Джейн Уотсон.
Главный герой противостоит не только уличной преступности, но и суперзлодеям — поэтому в сюжете фигурируют большинство классических злодеев Человека-паука, а именно: Кингпин, Зелёный гоблин, Хобгоблин, Ящер, Скорпион, Доктор Осьминог, Мистерио, Носорог, Шокер, Хамелеон, Стервятник, Гидромен, Веном, Карнаж, Могильщик, Кувалда, Сильвермейн, Алистер Смайт, Пятно, Крэйвен-охотник, Морбиус, Барон Мордо и Дормамму.
В сериале также появляются другие персонажи вселенной Marvel, такие как Люди Икс, Сорвиголова, Каратель, Фантастическая четвёрка, Воитель, Железный человек, Доктор Стрэндж, Блэйд, Ник Фьюри и Капитан Америка.
