У каждого должен быть свой реактор
Здрасьте здесь! Этот пост – сборная солянка. Я начал писать про ремонт реакционного модуля, но в процессе захотелось еще и объяснить, что это, для чего и как работает. Надеюсь, пост не будет утомительным.
И у меня есть свой реактор. Он, конечно, не ядреный и не такой большой и не такой теплый (и не ламповый), но выполняет весьма важную и нужную функцию.
Более официально он называется «реакционный модуль» и единственная его задача – смешать поток аналита с потоком дериватизатора, чтобы мы могли «увидеть» аналит на детекторе. Сейчас расскажу всё настолько подробно, насколько сам то разумею.
Как я уже писал в предыдущем посте про спектрофотометрические детекторы, чтобы увидеть аналит на хроматограмме, необходимо, чтобы он как-то взаимодействовал со светом или ультрафиолетовым излучением. Но не всегда вещество свет или УФ поглощает. Точнее – не «или», а «и». Есть аналиты, которые на спектрофотометрическом детекторе не видны и у нас, по сути, два пути: найти такой детектор, который сделает вещество видимым (например, флуориметрический, рефрактометрический и т. д.), либо сделать что-то с веществом, чтобы оно изменило свои свойства, но при этом не сильно повлиять на способность хроматографической колонки исследуемые вещества определять.
Такое действие – превращение вещества в видимую (детектируемую) форму, называется «дериватизация», а вещество, получающееся в результате – дериватом. Дериват обладает несколько иными свойствами, чем исходное вещество, а в некоторых случаях и вовсе самим веществом не является.
Аминокислоты (точнее, их натриевые соли, потому что в процессе подготовки пробы к анализу она на одном из этапов нейтрализуется гидроксидом натрия) практически невозможно увидеть на спектрофотометрическом детекторе в чистом виде, поэтому их «проявляют». Есть несколько способов такой «проявки», например, дериватизация аминокислот фенилизотиоцианатом (ФИТЦ). В этом варианте аминокислоты сначала дериватизируют, а уже после разделяют на обращенной фазе.
В нашем случае мы используем более классический способ – дериватизацию нингидрином уже после разделения аминокислот на катионообменной колонке. Это вполне себе ГОСТовый способ, известный давно и хорошо работающий, правда, не без недостатков.
Итак, нам нужны уже разделенные на колонке аминокислоты и нингидрин, поток которого мы будем добавлять в поток подвижной фазы, несущей аминокислоты в детектор. Для этого и служит наш реакционный модуль.
Внутри он достаточно прост:
Слева направо:
вентилятор на радиаторе охлаждения
термоблок, где происходит, собственно, дериватизация при температуре 110 градусов
контроллер, управляющий всей этой системой
блок насоса (синий), чуть ниже – клапаны переключения потоков и собственно панель управления
Да, стоит отметить, что это российская разработка одной российской компании, хотя и с множеством иностранных комплектующих.
Почему и зачем он находится в открытом виде? Потому что фото сделано в процессе ремонта, а точнее – замены длинного реакционного капилляра. Его длина около 8 метров и намотан он на небольшую шпулю, погруженную в силиконовое масло. И всё это находится в термоблоке, разогревающемся до 110 градусов.
Сам термоблок крупным планом (надпись сделал я, чтобы не перепутать в процессе ремонта, откуда капилляр выходит на детектор):
А это 8 метров плотно упакованного капилляра (здесь он уже снят со шпули):
Это засорившийся капилляр, из-за чего насосы не могли прокачать его и давление в системе росло до критического, после чего и реакционный модуль, и насос хроматографической системы отключались.
Точно такой же, но новый, был намотан и установлен в термоблок. После чего в тестовом режиме через него я прокачал несколько миллилитров изопропанола, подключил ВЭЖХ и воспроизвел работу в режиме разделения. Но конец капилляра, который обычно идет в детектор, на этот раз остался свободным. Итак, с конца капает капля...
Значит, система живет и функционирует нормально. Теперь вернемся к тому, что она делает.
Готовый к работе нингидрин выглядит так:
А так выглядит набор уже готовых буферов и промывок, которые приезжают к нам в готовом виде, поскольку заморачиваться с самостоятельным приготовлением уже как-то лень.
Иногда приходящие ко мне в лабораторию сторонние люди посмеиваются над этой фольгой, но, надо сказать, ничего проще и удобнее пока не придумано.
Что происходит: с колонки идет поток подвижной фазы, несущей уже разделенные (надеемся, что разделенные) аминокислоты. Реакционный модуль добавляет в этот поток нингидрин и отправляет в термоблок, где при нагревании реакция дериватизации проходит достаточно быстро.
Сам механизм этой реакции выглядит в упрощенном виде так:
Собственно, молекула нингидрина, связываясь с альфа-аминогруппой аминокислоты, после отщепления радикала R сама становится амином и присоединяет вторую молекулу нингидрина, в результате чего получается конечный продукт реакции – комплекс Рауэмана, имеющий в случае альфа-аминокислот ярко-синюю окраску и, что гораздо важнее, поглощающий в результате свет. Наиболее интенсивно это происходит на длине волны 570 нм.
На такой длине мы и ловим спектрофотометрическим детектором аминокислоты. Но более правильно будет сказать –комплекс Рауэмана, поскольку самой аминокислоты уже нет. Но так как реакция происходит количественно (одно и то же количество аминокислоты всегда дает одно и то же количество комплекса, а, следовательно, всегда одну и ту же интенсивность окращивания), то мы можем не только отметить наличие комплекса в потоке элюента, но и посчитать его концентрацию. Следовательно, мы можем посчитать и концентрацию аминокислоты (обычно в ммоль/мл, поскольку стандарт поставляется именно в такой размерности концентрации).
В случае таких аминокислот, как пролby и гидроксипролин, альфа-аминогруппа отсутствует, но комплекс образуется, однако уже другой, с желтоватой окраской и поглощает уже на длине волны 440 нм (наиболее интенсивно, конечно). Поэтому на практике детектирование ведется сразу на двух длинах волн (точнее, эти длины вычленяются из всего регистрируемого спектра).
Хроматограмма смеси аминокислот (в данном случае смеси стандартов аминокислот, по которому мы строим градуировки) выглядит так:
Можно увидеть, что это длина волны поглощения 570 нм.
Нингидрин «проявляет» не только аминокислоты, но и всё, что содержит аминогруппу. Так. он легко проявляет пептиды и белки. Если нингидрин попадает на кожу, она становится такой:
Окрашивание появляется не сразу, но остается на несколько дней. Такая реакция позволяет применять нингидрин в криминалистике, где распылением его раствора можно проявлять отпечатки пальцев на пористых поверхностях, например, на бумаге (и, что характерно, я это делал, но фотографию результата найти не смог).
После окончания работы реакционный модуль промывается смесью из воды, метанола и изопропанола в соотношении 50 : 25 : 25. Иначе нингидрин забьет капилляры, с чего, собственно, и начался этот пост (моя сотрудница забыла промыть реактор).
И на этом можно заканчивать и уходить домой. Спасибо всем, кто дочитал.