Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография⁠⁠

Дисклеймер: пост адресуется в основном студентам-химикам, а также может быть интересен для тех, кто когда-либо задавался вопросом, а чем вообще занимаются эти химики в своих лабораториях?!

Итак, сегодня мы разберемся, как «поставить колонку». Если пропустили, зачем это нужно – добро пожаловать в Часть 1. Вкратце: допустим, нужно отделить одно белое вещество от другого белого вещества…и от кучи всякого мерзкого.

Нам понадобится:

-хроматографическая колонка

-сорбент, он же неподвижная фаза

-элюент, он же подвижная фаза, он же какой-либо органический растворитель.

-раствор вашей смеси

-пипетка

-штатив с пробирками

-песочек

-выдержка и терпение

Сначала поподробнее о лабораторных колонках. Это цилиндрические трубки с сужением на конце, изготовленные из стекла или кварца. Современные для удобства снабжены краном на конце, так что в них можно регулировать поток и останавливать хроматографию в любой момент. Обычные стеклянные колонки не пропускают УФ, так что чтобы следить за ходом хроматографии можно ставить ТСХ с выходящего раствора или, если вам повезло, ориентироваться на цвет идущих пятен. Кварцевые колонки в этом плане удобнее – за продвижением пятна в них можно следить по УФ.

Выбирают колонку в зависимости от масштабов и сложности разделения: на широкой колонке можно поделить больше, на высокой - лучше.

Самым распространенным сорбентом в лабораториях остается силикагель. Он может быть разный по форме, размеру (35-70 мкм, 60-120 мкм, а для промышленных колонок - гораздо меньше) и по распределению частиц по размерам.

Чем более мелкие и однородные по размеру частицы, тем лучше будет разделение. Но за все хорошее приходится платить: мелкий силикагель плотно забивает колонку, так что жидкости будет сложнее проходить. В таком случае для ускорения процесса можно хроматографировать под давлением (т.е. в лаборатории – давить сверху с помощью груши или шприца).

*В качестве сорбента можно использовать не только силикагель, но и оксид алюминия. Михаил Цвет (тот чел, что изобрел препаративную хроматографию) вообще использовал карбонат кальция (попросту мел) для разделения пигментов.

Теперь наконец-то переходим к методике

Шаг 1. Закрепляем колонку на штативе. Если она без крана – затыкаем ее снизу ваткой. Также можно еще насыпать снизу небольшой слой песочка, чтобы покрыть сужение, и силикагель заполнять уже ровным слоем.

Шаг 2. Готовим элюент, который подобрали на первой стадии.

Шаг 3. Готовим суспензию силикагеля в элюенте.

Сколько взять силикагеля? Обычно ориентируются на массу разделяемой смеси и берут в 100 раз больше. То есть, если у нас 200 мг смеси, неплохо бы поделить их на 20 граммах силикагеля как минимум. НО важнейшим критерием для разделения все-таки остается высота колонки. Теми же 20 граммами можно заполнить широкую или узкую колонку, и в зависимости от этого будет различная высота слоя сорбента. При сложном разделении лучше всегда отдавать предпочтение колонке повыше. 

Если вы собираетесь проводить хроматографию в кварцевой колонке, и хотите смотреть за передвижением пятен – тут же добавляем УФ-индикатор (1% от массы силикагеля, то есть те же 200 мг, но можно и чуть меньше).

Теперь в сухую смесь остается долить элюент и все это тщательно перемешать. Чтобы максимально приблизиться к состоянию суспензии и выгнать все пузырьки воздуха, смесь обрабатывают на ультразвуке.

Шаг 4. Заполняем колонку. Для этого аккуратно выливаем суспензию силикагеля, следя, чтобы не образовывалось пустот (можно постукивать по колонке палочкой – так силикагель плотнее упакуется). Чтобы вылить весь приготовленный силикагель, остатки можно еще раз залить элюентом и добавить туда же.

Шаг 5. Нанесение вещества. Этот этап очень ответственный, и от него может зависеть весь успех вашего предприятия. Раствор нанести нужно так, чтобы не повредить верхний слой силикагеля. Можно дать ему аккуратно стечь по стенкам (но тогда еще дополнительный этап – смыть остатки со стенок), либо капля за каплей нанести по всему сечению колонки. После нанесения сверху насыпают слой песочка. Это поможет не повредить верхний слой силикагеля при элюировании и одновременно на какое-то время предотвратит пересыхание колонки, если вы проспите забудете подлить элюента.

Шаг 6. Элюирование. Кажется, здесь нет ничего сложного – стой да наливай сверху элюент, снизу собирай свои фракции по пробиркам. Важно не дать колонке пересыхать, иначе сорбент может растрескаться, что ухудшит разделение.

На небольшую колонку может уйти в среднем 200-500 мл элюента, в зависимости от того, какой Rf вашего вещества. Если Rf высокий – вещество выходит с колонки быстро, и большие объемы не понадобятся. Соответственно, при низком Rf элюирование будет долгим и печальным. Но! всегда можно сделать его более радостным, по ходу колонки потихоньку увеличивая полярность элюента. Это называется градиентным элюированием. Его очень удобно применять, если вам надо собрать вещество с низким Rf, но до него выходит еще куча примесей. Тогда первые пятна выгоняют на малополярных элюентах, а по мере их выхода плавно увеличивают полярность.

Следить за продвижением вещества по колонке можно с помощью той же УФ лампы. Вещество будет более темным пятном в сравнении c ярко-зеленым фоном.

Что ж, все собрано, Вы восхитительны!

Теперь с пробирок можно поставить ТСХ, чтобы точно определить в каких нужное вам вещество.

Что может пойти не так:

1. Может быть так, что ваши вещества не растворяются в элюенте. В этом случае можно воспользоваться способом сухого нанесения. Для этого вещество растворяют в подходящем легколетучем растворителе (например, ацетоне). К раствору добавляют немного (пару шпателей) силикагеля, тщательно перемешивают и упаривают. В итоге получается силикагель с равномерно нанесенным на него веществом, который насыпают сверху колонки и дальше элюируют как обычно. Слой силикагеля должен оказаться примерно такой же по уровню, как если бы вы налили раствор вещества.

2. При градиентном элюировании, если вы поспешили и начали увеличивать полярность элюента, не дав выйти первым пятнам, может случиться так, что последние пятна их догонят и перекроются. Поэтому увеличивать полярность желательно только после выхода каждого вещества.

3. Если на колонку загружено мало вещества, то по ходу колонки оно может постепенно исчезнуть из виду и больше не светиться в УФ. Остается по старинке собирать вещество по пробиркам, следя за окончанием по ТСХ или нанося каплю раствора на стекло: если после испарения растворителя остается след – что-то еще идет.

4. Самый тяжелый случай – это когда вещество разлагается на силикагеле. В итоге с колонки выйдет уже не то, что вы туда загрузили. Желательно до начала колонки удостоверится в стабильности вашего вещества на выбранном сорбенте. Это можно проверить с помощью двумерной ТСХ. Делается это так: ставится ТСХ на квадратной пластинке, причем пятно наносится с одного края. Когда элюент доходит до верха, ту же пластинку вынимают и переворачивают так, чтобы снизу оказалась та сторона, по которой прошло вещество. Если после такой операции пятна не увеличатся в количестве и останутся на диагонали, можно смело делить на колонке. В противном случае вам не повезло и придется искать другой способ очистки.

5. Не разделилось! Что ж, этому есть много разных причин: недостаточная высота колонки, неаккуратное нанесение, неплотно заполненная колонка (где-то образуются застойные зоны или наоборот, пустоты или трещины, где жидкость легко проходит), неправильно подобран элюент…

Если разница Rf меньше 0,1-0,2 вообще сложно получить качественное разделение на небольшой колонке. Тогда спасает только полуметровая колонка и очень много терпения.

Шаг последний

Собираем нужные фракции и упариваем растворитель.

Вариации

Описанный метод подпадает под определение жидкостной адсорбционной хроматографии, то есть тут важно, насколько вещество хорошо сорбируется/десорбируется. Кроме этого еще существует ионообменная (когда неподвижная фаза имеет на поверхности заряженные группы, что позволяет разделять ионы по величине заряда), аффинная (основанная на специфическом взаимодействии веществ с определенным лигандом, пришитым на неподвижную фазу, что удобно для очистки биомолекул), гель-проникающая (разделяет вещества по размерам молекул - чем они больше, тем хуже проникают в поры носителя и легче выходят) и другие виды хроматографии, каждый из которых хорош для определенного типа задач.

В следующих сериях рассмотрим еще один метод препаративной хроматографии, который как будто бы создан специально для ЛЛ.)