56

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография

Дисклеймер: пост адресуется в основном студентам-химикам, а также может быть интересен для тех, кто когда-либо задавался вопросом, а чем вообще занимаются эти химики в своих лабораториях?!

Итак, сегодня мы разберемся, как «поставить колонку». Если пропустили, зачем это нужно – добро пожаловать в Часть 1. Вкратце: допустим, нужно отделить одно белое вещество от другого белого вещества…и от кучи всякого мерзкого.

Нам понадобится:

-хроматографическая колонка

-сорбент, он же неподвижная фаза

-элюент, он же подвижная фаза, он же какой-либо органический растворитель.

-раствор вашей смеси

-пипетка

-штатив с пробирками

-песочек

-выдержка и терпение

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Сначала поподробнее о лабораторных колонках. Это цилиндрические трубки с сужением на конце, изготовленные из стекла или кварца. Современные для удобства снабжены краном на конце, так что в них можно регулировать поток и останавливать хроматографию в любой момент. Обычные стеклянные колонки не пропускают УФ, так что чтобы следить за ходом хроматографии можно ставить ТСХ с выходящего раствора или, если вам повезло, ориентироваться на цвет идущих пятен. Кварцевые колонки в этом плане удобнее – за продвижением пятна в них можно следить по УФ.

Выбирают колонку в зависимости от масштабов и сложности разделения: на широкой колонке можно поделить больше, на высокой - лучше.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Самым распространенным сорбентом в лабораториях остается силикагель. Он может быть разный по форме, размеру (35-70 мкм, 60-120 мкм, а для промышленных колонок - гораздо меньше) и по распределению частиц по размерам.

Чем более мелкие и однородные по размеру частицы, тем лучше будет разделение. Но за все хорошее приходится платить: мелкий силикагель плотно забивает колонку, так что жидкости будет сложнее проходить. В таком случае для ускорения процесса можно хроматографировать под давлением (т.е. в лаборатории – давить сверху с помощью груши или шприца).

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

*В качестве сорбента можно использовать не только силикагель, но и оксид алюминия. Михаил Цвет (тот чел, что изобрел препаративную хроматографию) вообще использовал карбонат кальция (попросту мел) для разделения пигментов.

Теперь наконец-то переходим к методике

Шаг 1. Закрепляем колонку на штативе. Если она без крана – затыкаем ее снизу ваткой. Также можно еще насыпать снизу небольшой слой песочка, чтобы покрыть сужение, и силикагель заполнять уже ровным слоем.

Шаг 2. Готовим элюент, который подобрали на первой стадии.

Шаг 3. Готовим суспензию силикагеля в элюенте.

Сколько взять силикагеля? Обычно ориентируются на массу разделяемой смеси и берут в 100 раз больше. То есть, если у нас 200 мг смеси, неплохо бы поделить их на 20 граммах силикагеля как минимум. НО важнейшим критерием для разделения все-таки остается высота колонки. Теми же 20 граммами можно заполнить широкую или узкую колонку, и в зависимости от этого будет различная высота слоя сорбента. При сложном разделении лучше всегда отдавать предпочтение колонке повыше. 

Если вы собираетесь проводить хроматографию в кварцевой колонке, и хотите смотреть за передвижением пятен – тут же добавляем УФ-индикатор (1% от массы силикагеля, то есть те же 200 мг, но можно и чуть меньше).

Теперь в сухую смесь остается долить элюент и все это тщательно перемешать. Чтобы максимально приблизиться к состоянию суспензии и выгнать все пузырьки воздуха, смесь обрабатывают на ультразвуке.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Шаг 4. Заполняем колонку. Для этого аккуратно выливаем суспензию силикагеля, следя, чтобы не образовывалось пустот (можно постукивать по колонке палочкой – так силикагель плотнее упакуется). Чтобы вылить весь приготовленный силикагель, остатки можно еще раз залить элюентом и добавить туда же.

Шаг 5. Нанесение вещества. Этот этап очень ответственный, и от него может зависеть весь успех вашего предприятия. Раствор нанести нужно так, чтобы не повредить верхний слой силикагеля. Можно дать ему аккуратно стечь по стенкам (но тогда еще дополнительный этап – смыть остатки со стенок), либо капля за каплей нанести по всему сечению колонки. После нанесения сверху насыпают слой песочка. Это поможет не повредить верхний слой силикагеля при элюировании и одновременно на какое-то время предотвратит пересыхание колонки, если вы проспите забудете подлить элюента.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Шаг 6. Элюирование. Кажется, здесь нет ничего сложного – стой да наливай сверху элюент, снизу собирай свои фракции по пробиркам. Важно не дать колонке пересыхать, иначе сорбент может растрескаться, что ухудшит разделение.

На небольшую колонку может уйти в среднем 200-500 мл элюента, в зависимости от того, какой Rf вашего вещества. Если Rf высокий – вещество выходит с колонки быстро, и большие объемы не понадобятся. Соответственно, при низком Rf элюирование будет долгим и печальным. Но! всегда можно сделать его более радостным, по ходу колонки потихоньку увеличивая полярность элюента. Это называется градиентным элюированием. Его очень удобно применять, если вам надо собрать вещество с низким Rf, но до него выходит еще куча примесей. Тогда первые пятна выгоняют на малополярных элюентах, а по мере их выхода плавно увеличивают полярность.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Следить за продвижением вещества по колонке можно с помощью той же УФ лампы. Вещество будет более темным пятном в сравнении c ярко-зеленым фоном.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Что ж, все собрано, Вы восхитительны!

Теперь с пробирок можно поставить ТСХ, чтобы точно определить в каких нужное вам вещество.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Что может пойти не так:

1. Может быть так, что ваши вещества не растворяются в элюенте. В этом случае можно воспользоваться способом сухого нанесения. Для этого вещество растворяют в подходящем легколетучем растворителе (например, ацетоне). К раствору добавляют немного (пару шпателей) силикагеля, тщательно перемешивают и упаривают. В итоге получается силикагель с равномерно нанесенным на него веществом, который насыпают сверху колонки и дальше элюируют как обычно. Слой силикагеля должен оказаться примерно такой же по уровню, как если бы вы налили раствор вещества.

2. При градиентном элюировании, если вы поспешили и начали увеличивать полярность элюента, не дав выйти первым пятнам, может случиться так, что последние пятна их догонят и перекроются. Поэтому увеличивать полярность желательно только после выхода каждого вещества.

3. Если на колонку загружено мало вещества, то по ходу колонки оно может постепенно исчезнуть из виду и больше не светиться в УФ. Остается по старинке собирать вещество по пробиркам, следя за окончанием по ТСХ или нанося каплю раствора на стекло: если после испарения растворителя остается след – что-то еще идет.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

4. Самый тяжелый случай – это когда вещество разлагается на силикагеле. В итоге с колонки выйдет уже не то, что вы туда загрузили. Желательно до начала колонки удостоверится в стабильности вашего вещества на выбранном сорбенте. Это можно проверить с помощью двумерной ТСХ. Делается это так: ставится ТСХ на квадратной пластинке, причем пятно наносится с одного края. Когда элюент доходит до верха, ту же пластинку вынимают и переворачивают так, чтобы снизу оказалась та сторона, по которой прошло вещество. Если после такой операции пятна не увеличатся в количестве и останутся на диагонали, можно смело делить на колонке. В противном случае вам не повезло и придется искать другой способ очистки.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

5. Не разделилось! Что ж, этому есть много разных причин: недостаточная высота колонки, неаккуратное нанесение, неплотно заполненная колонка (где-то образуются застойные зоны или наоборот, пустоты или трещины, где жидкость легко проходит), неправильно подобран элюент…

Если разница Rf меньше 0,1-0,2 вообще сложно получить качественное разделение на небольшой колонке. Тогда спасает только полуметровая колонка и очень много терпения.

Шаг последний

Собираем нужные фракции и упариваем растворитель.

Как делить всякое: все, что вы хотели, но боялись спросить  о хроматографии. Часть 2. Колоночная хроматография Химия, Органическая химия, Хроматография, Длиннопост

Вариации

Описанный метод подпадает под определение жидкостной адсорбционной хроматографии, то есть тут важно, насколько вещество хорошо сорбируется/десорбируется. Кроме этого еще существует ионообменная (когда неподвижная фаза имеет на поверхности заряженные группы, что позволяет разделять ионы по величине заряда), аффинная (основанная на специфическом взаимодействии веществ с определенным лигандом, пришитым на неподвижную фазу, что удобно для очистки биомолекул), гель-проникающая (разделяет вещества по размерам молекул - чем они больше, тем хуже проникают в поры носителя и легче выходят) и другие виды хроматографии, каждый из которых хорош для определенного типа задач.


В следующих сериях рассмотрим еще один метод препаративной хроматографии, который как будто бы создан специально для ЛЛ.)

Дубликаты не найдены

Лига Химиков

1.1K постов10K подписчиков

Добавить пост

Правила сообщества

Старайтесь выбирать качественный контент и не ставьте теги моё на копипасты

Посты с просьбой решения домашнего задания переносятся в общую ленту

Также нельзя:

1. Оскорблять пользователей.

2. Постить материал далеко не по теме и непотребный контент (в остальном грамотно используйте теги)

3. Рекламировать сомнительные сайты и услуги коммерческого характера

Подробнее
+3
А у меня атомно-эмиссионный спектрометр с индуктивно связанной плазмой :) Это я хвастаюсь. А вы занимаетесь реально интересными вещами!
0
Эх, где этот пост был, когда училась, все понятно и ясно
0
ТС привет! А про ГХ посты ждать?
раскрыть ветку 3
+1

про ГХ было уже достаточно наглядно: Сколько стоит лабу построить? ч. 6

собственно, там же и про ВЭЖХ

раскрыть ветку 2
0

Поэтому теоретиком быть лучше)

0

Хроматография белков на сефадексах.... Микроколоночная высокого давления.... Тонкослойная  бумажная и силикагелевая.... Градиентная на ионообменниках. А настройка проточного спектрофотометра.... У меня диплом был с темой хроматография пептидов на микроколоночной системе высокого давления в концентрированной трифторуксусной кислоте. Молодость молодость.

0

А я таким же шприцом со шлангом кактусы поливаю :-)

0

Интересно. А можно чуть подробнее о двумерной ТСХ? Есть какие-нибудь примеры неудачных вариантов, когда вещество разлагается? И какую информацию можно извлечь из такой неудавшейся ТСХ?

раскрыть ветку 1
+1

Фоток, к сожалению, нет


Но будет видно, что из одного пятна появилось несколько с другими Rf, что означает, что вещество либо разлагается при взаимодействии с силикагелем, либо на воздухе успевает окислиться, либо элюент с ним что-то делает


выглядеть это будет примерно так:

Иллюстрация к комментарию
0

Сегодня есть ВЭЖХ, какое применение у таких методов? Чтобы студенты научились основам хроматографии?

раскрыть ветку 4
+3
ВЭЖХ плюсов много, но минусов ещё больше.
1. ОООчень дорогое удовольствие.
2. Разделение на приборе процесс весьма не быстрый. Пока сорбент подберешь, пока элюент, пока градиент...
На колонке(на коленке) две-три ТСХ и в путь.
+1

ВЭЖХ это, конечно, хорошо, но что если надо поделить полграмма?

Так что если смотреть научные статьи по органическому синтезу, там почти везде выделяют колоночной хроматографией

раскрыть ветку 1
0
Мы в лаборатории делили платиновые комплексы для последующих синтезов. Дёшево, быстро, не привлекаются посторонние люди, опять же, не всегда заранее понятно, насколько хорошо разделится, какие компоненты будут.

И да, это на самой богатой кафедре химфака.
0
Не химик. Поняла через два ,три слова . Но плюсую,интересно
-2

Да всем похую

Похожие посты
287

Кристаллы продукта реакции фенольного соединения и свободного радикала

Кристаллы продукта реакции фенольного соединения и свободного радикала Химия, Лига химиков, Органическая химия, Кристаллы, Микросъёмка, Длиннопост
Показать полностью 1
304

Добро пожаловать в органическую химию!

Добро пожаловать в органическую химию! Химия, Органическая химия, Профессиональный юмор
Добро пожаловать в органическую химию! Химия, Органическая химия, Профессиональный юмор
136

Кристаллы 4-бензоилокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила

Кристаллы 4-бензоилокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила Химия, Лига химиков, Органическая химия, Кристаллы, Микросъёмка, Длиннопост
110

Кристаллы 1-этинил-1-циклогексанола

Кристаллы 1-этинил-1-циклогексанола Химия, Лига химиков, Органическая химия, Кристаллы, Микросъёмка, Длиннопост
Показать полностью 1
690

Тонкослойная хроматография чернил в ускоренной съемке

Тонкослойная хроматография чернил в ускоренной съемке Химия, Гифка, Хроматография, Чернила
94

Тонкослойная хроматография для не-специалистов

Показать полностью
115

Кристаллы N-гидроксисукцинимида

Кристаллы N-гидроксисукцинимида Химия, Лига химиков, Органическая химия, Кристаллы, Микросъёмка
56

Таблица органических «элементов»

Таблица органических «элементов» Химия, Органическая химия, Химические элементы, Длиннопост
Таблица органических «элементов» Химия, Органическая химия, Химические элементы, Длиннопост
Таблица органических «элементов» Химия, Органическая химия, Химические элементы, Длиннопост
Таблица органических «элементов» Химия, Органическая химия, Химические элементы, Длиннопост
Таблица органических «элементов» Химия, Органическая химия, Химические элементы, Длиннопост
Показать полностью 4
123

Кристаллы N-бензилоксифталимида

Кристаллы N-бензилоксифталимида Химия, Лига химиков, Органическая химия, Кристаллы, Микросъёмка
234

Циклопентадиенилтрикарбонилгидридвольфрам

Циклопентадиенилтрикарбонилгидридвольфрам Химия, Лига химиков, Вольфрам, Органическая химия, Статья, Длиннопост
Циклопентадиенилтрикарбонилгидридвольфрам Химия, Лига химиков, Вольфрам, Органическая химия, Статья, Длиннопост
Циклопентадиенилтрикарбонилгидридвольфрам Химия, Лига химиков, Вольфрам, Органическая химия, Статья, Длиннопост
Циклопентадиенилтрикарбонилгидридвольфрам Химия, Лига химиков, Вольфрам, Органическая химия, Статья, Длиннопост
Циклопентадиенилтрикарбонилгидридвольфрам Химия, Лига химиков, Вольфрам, Органическая химия, Статья, Длиннопост
Циклопентадиенилтрикарбонилгидридвольфрам Химия, Лига химиков, Вольфрам, Органическая химия, Статья, Длиннопост

Показать полностью 5
34

Стабильные радикалы

Стабильные радикалы Органическая химия, Химия, Химическая реакция, Гифка, Длиннопост
Стабильные радикалы Органическая химия, Химия, Химическая реакция, Гифка, Длиннопост
Стабильные радикалы Органическая химия, Химия, Химическая реакция, Гифка, Длиннопост
Стабильные радикалы Органическая химия, Химия, Химическая реакция, Гифка, Длиннопост
Стабильные радикалы Органическая химия, Химия, Химическая реакция, Гифка, Длиннопост
Стабильные радикалы Органическая химия, Химия, Химическая реакция, Гифка, Длиннопост
Показать полностью 4
Похожие посты закончились. Возможно, вас заинтересуют другие посты по тегам: