Химический анализ вчера и сегодня⁠⁠

Столь избитый заголовок у этого поста лишь потому, что другого мне придумать не удалось.

Недавно мне попался в руки справочник, где в числе прочих приводилась схема анализа афлатоксинов в кормах для животных. А поскольку токсины плесневых грибов – это та самая тема, которой я плотно занимаюсь сейчас, соответствующий раздел в справочнике стал предметом внимательного изучения.

Микотоксины в общем – вторичные метаболиты множества плесневых грибов, а в ещё более широком смысле микотоксинами можно называть вообще все токсичные вторичные метаболиты всех грибов. Поэтому, например, аманитин и фаллоидин бледной поганки, вызывающие смертельное отравление человека, тоже являются микотоксинами в этой системе отсчета.

Но большинство микотоксинов, всё же, продуцируется плесневыми грибами и сегодня известно более 400 веществ, токсичность которых установлена. Сколько их будет открыто ещё, сказать сложно.

Вполне естественно, что открытие такого количества токсинов стало возможным, благодаря и развитию аналитических методов, которые постепенно переходят из разряда экспериментальных в разряд повседневных лабораторных. Например, не так давно масс-спектрометрия была экспериментальным методом, а сегодня она стала основой основ.

В справочнике приведены схемы анализа афлатоксинов, охратоксина-А, Т-2 токсина и некоторых других. Тем интереснее было сравнить, как изменился анализ этих веществ за 30 лет с момента выхода книги (издание 1991 года).

1991 год. Анализ содержания афлатоксинов В1 и С1

тут сложно разобраться, какие из афлатоксинов имелись в виду, поскольку сегодня анализируется четыре афлатоксина – B1, B1, G1, G2, а в молочных продуктах, полученных из молока животных, пораженных афлатоксинами, содержатся афлатоксины M1 и M2

Афлактосины – вещества группы поликетидов и кроме основных токсинов имеют достаточно много токсичных производных и метаболитов, среди которых афлатоксикол, стеригматоцистины, аспертоксин и прочие. Но основной вклад в токсическое действие вносят указанные выше четыре токсина.

Чувствительность организмов к афлатоксинам весьма различается. Интересно, что наименее чувствительны к ним лабораторные мыши. Но есть животные, для которых доза в 1 мкг/кг пищи уже является крайне токсичной. Сюда можно отнести телят и поросят.

Человек также подвержен действию афлатоксинов и находится где-то в середине шкалы чувствительности. Содержание в 5 мкг/кг образца является предельно допустимым для всех пищевых продуктов, в которых афлатоксины B и G можно встретить.

Практически любой продукт растительного происхождения, особенно содержащий семена бобовых, например, арахиса, сои, риса, пшеницы, орехов например, грецких, миндальных, фисташек содержат те или иные количества афлатоксинов. Даже чай, который хранили в ненадлежащих условиях, через некоторое время уже будет содержать как самого продуцента афлатоксинов (в частности – Aspergillus flavus или Аспергилл желтый), так и сами токсины.

Но не стоит отчаиваться. Соблюдение условий хранения и покупка продуктов, прошедших соответствующий контроль (а таковой на предприятиях пищевой промышленности весьма строг и мне еще не попадалось ни одного образца промышленного производства, где бы афлатоксины находились в количествах выше нижней границы обнаружения) практически избавляют вас от этих токсинов.

Но вернемся к основной теме. В справочнике 1991 года анализу афлактосинов посвящено почти три страницы убористого текста. Заявленная чувствительность – 10 мкг/кг. Нам предлагается выполнить следующие операции:

1. Из 50 граммов образца 150 мл смеси ацетон-вода с объемными соотношениями 85 : 15 в течение 45 минут на шейкере (а конкретно – на шуттель-аппарате) провести извлечение токсинов и собрать первые 75 мл экстракта, профильтрованного через бумажный фильтр (наиболее распространенный фильтр – т. н. «синяя лента»).

1. Далее требуется очистить экстракт 50 мл гексана в делительной воронке, энергично встряхивая и добавив после этого 120 мл 4% раствора хлорида натрия. Слить нижний водно-ацетоновый раствор, предполагая, что все сторонние вещества, мешающие анализу, находятся в гексане.

   Шуттель-аппарат (встряхиватель)

2. Теперь нам нужно перелить водно-ацентоновый раствор в другую делительную воронку и добавить туда 25 мл хлороформа, перемешать и дать слоям разделиться. Нижний слой (хлороформ) сливают в колбу на 200–250 мл, куда уже помещен безводный сульфат натрия, через бумажный фильтр.

3. Пункт 3 требуется повторить еще три раза, добавляя по 25 мл хлороформа каждый раз и сливая его в ту же колбу с сульфатом натрия через фильтр, который далее нужно промыть 10 мл хлороформа.

   1. Предлагается вариант экстракции в бензол, с которым общая схема будет той же.

4. После всего этого длительного процесса нам предлагается упарить экстракт объемом 110 мл (25 + 25 + 25 + 25 + 10) на водяной бане до 5 мл. Упаривание такого объема хлороформа, конечно, не представляет технической сложности, поскольку температура его кипения составляет 61,2 градуса Цельсия, но само по себе упаривание такого объема выглядит пугающе. Другое дело, что упаривание можно проводить в роторном испарителе и собирать испаряющийся хлороформ, а не выбрасывать его через вытяжку.

   Роторный испаритель (без насоса, но с водяной баней) с электрическим лифтом.

5. Следующим этапом нам предлагают очистить оставшиеся 5 мл экстракта на хроматографической колонке с силикагелем (1 см по высоте колонки) и оксидом алюминия (2–2,5 см по высоте колонки над слоем силикагеля), на который помещают еще 3 см безводного сульфата натрия.

6. Элюирование происходит смесью хлороформа и ацетона в объемных соотношениях 9 : 1 объемом 100 мл под слабым разрежением.

7. Элюат переносят в колбу Эрленмейера и упаривают снова до объёма 4–5 мл, переносят в мерную пробирку на 10 мл, обмывая колбу хлороформом и доводят раствор до метки (конечный объем, стало быть, будет равен 10 мл).

8. Теперь начинается собственно анализ методом тонкослойной хроматографии, для чего на хроматографическую пластину наносят анализируемый раствор в нескольких повторениях в разных объемах (например, 20, 5, 2, 1 мкл) и наносят также 5 мкл стандартного раствора афлатоксинов с концентрацией 0,5 мкг/мл токсинов B1 и G1. Пластинку сушат на воздухе и проводят разделение.

   Хроматографическая пластинка для тонкослойной хроматографии (один из вариантов). Иногда поставляются в виде больших пластин, которые можно нарезать стеклорезом на заданного размера части.

9. Первое разделение выполняется в системе толуол – этилацетат – муравьиная кислота в объемных отношениях 5 : 4 : 1 (муравьиная кислота берется в виде 85% раствора). Когда растворитель поднимется по пластинке на 10 см над линией старта, её высушивают и проводят второе разделение.

10. Второе разделение выполняется в системе хлороформ – метанол в объемных отношениях 99 : 1, дожидаясь, пока элюент поднимется по пластинке на 13 см. Если потребуется определить только афлатоксин В1, выполняется только пункт 9.

11. Пластинку высушивают и просматривают в ультрафиолете с длиной волны 365 нм. Концентрацию определяют расчетом через объем пробы, дающей наименьшую флуоресценцию.

На всё это отводится 3 часа рабочего времени. В случае же, если флуоресценция в исследуемых образцах слишком сильная, требуется разбавить пробу в 50 раз и провести разделение повторно.

Сегодня этот процесс кажется слишком громоздким, хотя и существуют, например, полностью автоматизированные системы тонкослойной хроматографии (например, системы CAMAG, в которых есть все составляющие, от системы нанесения образцов на пластины, до дериватизаторов и сканеров пластин с полностью автоматизированным процессом). Кому будет интересно, можно посмотреть видео, где CAMAG презентует свою систему, рассказывая, какая она замечательная. Не реклама, так как я сам никогда с TLC (thin-layer chromatography) не имел дела и смотрю такие видео исключительно в порядке самообразования, хотя TLC и находит весьма широкое применение в химическом анализе, и я надеюсь когда-нибудь научиться работать с нею.

Впрочем, подготовка пробы к анализу всегда отнимала много времени, но в данном случае впечатляет объем растворителей, требуемых для подготовки пробы и объем выполняемой работы.

Но это было в 1991 году. Что же мы имеем сегодня?

2023 год.

Данные методы используются давно. Сейчас я работаю с двумя методами для определения микотоксинов – жидкостной хроматографией (ВЭЖХ или HPLC) и методом иммуноферментного анализа (ИФА или ELISA).

В первом случае нам потребуется вполнить следующие действия:

1. Из 50 (25, 10 граммов, по доступности образца, хотя представительно будет извлечение из 50 граммов) каким-либо органическим растворителем (например, ацетонитрилом или метанолом) объемом 100 мл в течение 5 минут перемешивания в лабораторном блендере извлекаются токсины.

2. Далее смесь фильтруется и из нее отбирается 2 мл, которые смешиваются с 14 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), который поставляется готовым в таблетках, которых требуется 10 штук для получения 1 литра ФСБ (да, да, у нас есть шутка про ФСБ в таблетках или таблетки ФСБ).

3. После этого полученные 16 мл пропускаются через иммуноаффинную колонку, специфичную для каждого токсина (ИАФ-колонки для афлатоксинов селективно удерживают все четыре исследуемых афлатоксина) буквально самотеком.

   Иммуноаффинные колонки для выделения афлатоксинов (в данном случае)

4. Удерживаемые токсины смываются с колонки в стеклянную пробирку или виалу 3 мл метанола, который затем упаривается в токе азота.

5. Сухой остаток растворяют в 400 мкл смеси ацетонитрила и воды в объемных соотношениях 1 : 9 (пробирку или виалу при этом закрывают и встряхивают на вортексе 2–3 минуты).

6. Полученный раствор анализируется методом ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке в градиентном режиме с тремя компонентами подвижной фазы: А – вода, В – метанол, С – ацетонитрил (поток по методике Shimadzu – 1 мл/мин)

7. Чтобы повысить чувствительность, можно заставить афлатоксины флуоресцировать сильнее. Для этого сухой остаток из пункта 4 обрабатывают 100 мкл трифторуксусной кислоты 15 минут в темноте при комнатной температуре, а затем также растворяют в 400 мкл смеси ацетонитрил – вода с объемными соотношениями 1 : 9 и анализируют методом ВЭЖХ в градиентном режиме с двумя компонентами подвижной фазы: А – вода – метанол – ацетонитрил в объемных соотношениях 6 : 3 : 1, В – ацетонитрил (поток по методике Shimadzu – 0,8 мл/мин).

8. Детектируют афлатоксины на флуоресцентном детекторе с волной возбуждения 365 нм и на волне излучения 450 нм.

По сути, это вся процедура подготовки и анализа. На системе ВЭЖХ полное разделение четырех афлатоксинов занимает 32 минуты, из которых примерно половина времени уходит на смыв с колонки сторонних веществ, а сами токсины разделяются к 15 минуте. Ниже скрин программы LabSolution с примером разделения смеси стандартов афлатоксинов (стандарты жидкие, раствор в ацетонитриле, производитель – Trilogy).

Метод ВЭЖХ очень точен, позволяет разделить четыре афлатоксина, когда это требуется. Кроме того, позволяет работать даже с одним образцом. Применение масс-спетрометрии и вовсе может облегчить работу, но пока я не знаком с нею.

Второй метод – ИФА. Он несколько более требователен к количеству одновременно исследуемых образцов, но не требует при этом очистки экстракта и выполняется очень быстро.

Что нужно сделать для того, чтобы исследовать образец на содержание, например, тех же афлатоксинов методом ИФА:

1. 5 граммов образца, измельченного до отсева на сите 0.2 мм (лучше и вовсе в пыль), заливают 25 мл смеси метанол – вода в объемных соотношениях 70 : 30 и экстрагируют 5–7 минут, перемешивая емкость на шейкере. В качестве емкости может выступать как стеклянная колба объемом от 100 мл и закрытая пробкой, так и большая пластиковая пробирка с крышкой объемом 50 мл.

2. Далее раствор фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» и собирают в пробирку для дальнейшего анализа (достаточно 1–2 мл). На этом процедура подготовки пробы заканчивается.

   Фильтрация образцов через бумажный фильтр в стеклянную колбу. Экстракция проводилась в пластиковых пробирках на 50 мл. Рядом стоят пробирки на 5 мл для сбора фильтрата.Теперь

3. Теперь всё зависит от производителя тест-системы, которая поставляется в полностью укомплектованном виде, включая все необходимые реагенты и планшеты (за исключением наконечников для дозаторов и, конечно же, самих дозаторов). В некоторых случаях требуется дополнительное разбавление пробы раствором из комплекта тест-системы (например, один из производителей предписывает разбавление пробы в соотношении 1 : 7 раствором для разбавления).

   Тест-системы поставляются в готовом виде в коробках, где есть всё необходимое. В зависимости от производителя комплектация может различаться, как несколько отличным будет и протокол работы с системой, но в целом различия несущественны.

4. В планшет для анализа помещаются стандартные растворы токсина (от 1 до 6 у разных производителей) и исследуемые растворы. Туда же добавляется конъюгат, выполняется инкубация (от 15 до 30 минут), проводится промывка планшета буферным раствором для промывания (также есть в составе тест-системы).

   Стандартные планшеты для ИФА и перенос образцов между планшетами (в некоторых системах используется один планшет)

5. В промытый планшет, из которого выбиты все капли жидкости, добавляется хромоген-субстратный раствор, который после инкубации (от 5 до 15 минут) становится цветным (например, голубым).

   Планшет после инкубации. Растворы окрашиваются в синий цвет.

6. После инкубации реакция останавливается стоп-раствором, которым обычно является 1М серная кислота, и раствор окрашивается в желтый цвет.

   После внесения стоп-реагента растворы в лунках планшета становятся желтыми и готовы к сканированию на планшетном сканере.

7. Далее планшет по заданной программе сканируется планшетным сканером и в качестве результата обычно получается оптическая плотность растворов в лунках планшета на длине волны 450 нм, которая пересчитывается в концентрации в программе, предлагаемой производителем тест-систем, или же в файле Excel, который также предлагает производитель (в данном случае всё зависит от производителя, но принцип в обоих случаях одинаков).

Анализ даже нескольких десятков образцов занимает буквально 30–60 минут, включая время на размещение образцов в лунках планшета. Выполняется обычно в двукратной повторности (в планшет образцы размещаются дважды), но допускается и однократная, хотя это и не желательно во многих случаях.

Из минусов: многие производители предлагают тест-системы с 5–6 стандартами, что ограничивает количество анализируемых образцов количеством не менее 2–3, а лучше 10–11, чтобы использовать тест-систему наиболее рационально.

Более того, можно без каких-либо последствий исключить из процесса подготовки проб пункт 2, если проводить экстракцию в центрифужных пробирках и центрифугировать после экстракции. Можно сразу собирать надосадочную жидкость и анализировать её. Поскольку у меня пока нет центрифуги для больших пробирок, я даю пробиркам после встряхивания отстояться пять минут и переливаю верхний слой в пробирки типа эппендорф на 1,5 мл и так же центрифугирую примерно на 6000 оборотах.

Так мы избавляемся от множества стеклянных колб и воронок, а также бумажных фильтров, чем сильно облегчаем себе жизнь. Деконтаминировать и мыть после анализа нам придется лишь большие пластиковые пробирки, а эппендорфы – одноразовые (деконтаминация, к слову, проводится раствором гипохлорита натрия, буквально «хлоркой» или «Белизной» в течение 15–20 минут встряхиванием ополоснутой от остатков образца пробирки на шейкере).

ИТОГ:

Итог достаточно простой: если еще в 1991 году для анализа афлатоксинов требовалось проделать весьма длительную и трудоёмкую работу, которая включала операции с весьма токсичными растворителями, то сегодня мы работаем, прежде всего, в объемах, в разы меньших, чем тогда и с растворителями, куда менее токсичными.

Сама процедура подготовки к анализу и самого анализа стала, вероятно, на порядок проще. Конечно, выросла стоимость анализа в денежном выражении (например, один тест-набор стоит сейчас от 40 до 65 тысяч рублей в зависимости от исследуемого токсина и производителя, одна иммуноаффинная колонка для выделения токсинов – что-то около 500 рублей, в остальном порядок цен примерно такой же). Но точность и скорость выполнения анализа, возможность передать выполнять его без работы с токсичными веществами, на мой взгляд полностью окупает все расходы.

Говоря проще, менее чем за 15 лет (методы, которые я здесь описал, применяются широко уже достаточно давно) анализ микотоксинов стал настолько простым, что выполнять его теперь может в некоторых случаях даже школьник, которого обучили работать с многоканальным и одноканальным механическими дозаторами.

Спасибо, что дочитали до конца. Надеюсь, что было не скучно. Если у вас будут вопросы, постараюсь отвечать на них.