BacterioPhage

BacterioPhage

на Пикабу
It is a question of mind over matter. They don't mind and we don't matter
поставил 25676 плюсов и 113 минусов
отредактировал 2 поста
проголосовал за 3 редактирования
24К рейтинг 225 подписчиков 3322 комментария 4 поста 3 в горячем
2329

Ответ на пост «Самолетные истории» 

Или я не еврей, но 1000 шекелей это 1000 шекелей.


Более полугода назад. Летел с Москвы в Тель-Авив. На середине рейса назрела необходимость посетить комнату для размышлений. На дверях кабинок, как обычно, находилась табличка занято / свободно, реагирующая на замок изнутри. Убедившись, что на табличке заветное "свободно", открываю дверь и моим глазам во всей красе предстаёт юная девица. Быстро закрываю дверь и возвращаюсь на свое место. "Подумаю позже", подумал я, нацепил маску на глаза и уже почти засыпал, как мне прямо по маске прилетает удар. Молодой и горячий человек юной девицы решил устроить разборки со мной. На мой аргумент, что на табличке была надпись "свободно", парочка блестяще (нет) парировала тем, что девица побрезговала прикасаться к задвижке. Однако мой следующий аргумент, что, как ни странно, ни рентгеновским зрением, ни телепатией, ни особо развитой интуицией, как и даром предвидения, я не обладаю, они парировать все же не смогли. А подоспевшее подкрепление в виде стюардессы на моей стороне вынудили сладкую парочку перейти к стадии переговоров. Так я стал немного красивее на две недели и богаче на 1000 шекелей (1 шекель - 17.9 руб. по текущему курсу).

Думать выгодно.


Upd.

Очень много комментариев, что я терпила и тому подобное - лично мне ситуация больше казалась забавной, чем конфликтной. Или меня ударили по голове сильнее, чем мне показалось? Хм..

124

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают

Всем привет!

Так уж получилось, что сейчас немного осваиваю биоинформатические методы исследования.

Попрошу знающих отписаться в комментариях с советами, так как все делал по статьям и протоколам с интернета.

В настоящее время изучаем в основном микробиом почвы и ризосферы, и недавно подготавливал новую 16S библиотеку.


Для подготовки 16S библиотеки нужно :

1. Выделить ДНК

2. Амплифицировать нужный участок ДНК

3. Прикрепить баркоды - специальные метки, разные для ДНК из каждого образца.

4. Секвенирование - считывание последовательности нуклеотидов из ДНК в 16S библиотеке.


Прежде всего необходимо выделить ДНК из образцов (у меня - почва, но это может быть кровь, растительные или животные ткани, кал, на что фантазии хватит). Можно использовать коммерческие киты, или наборы, например, Power Soil для почвы, Blood & Tissue для крови и тканей, от разных производителей. Я использовал Power Soil и все образцы у меня были из почвы,  однако захотелось мне проверить, на будущее, как поведёт себя набор для экстрагирования ДНК из почвы со swab образом (типа ватной палочки, смоченной в одном из буфферов для ДНК или ультрачистой воде, которой можно забрать мелкие объекты с ДНК с какой либо поверхности)

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

Так что я взял такую палочку, смочил в TE буффере и провел себе по лбу. А так как мне интересно узнать эффективность данного набора при работе с не предусмотренным разработчиком источником, я едва касался палочкой кожи.

Выделение ДНК подробно описывать не буду, так как слишком долго, и я это уже описывал ранее в одном из постов со старого аккаунта, который я удалил по личным обстоятельствам. Может, кто меня даже и вспомнит)).

Работал под ламинаром для уменьшения вероятности контаминации образцов (попадания ДНК из других источников).

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

В одну библиотеку можно включить сразу большое количество образцов. Обычно работают с плашками на 96 лунок, фото с нета для примера.

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

По итогу имеем плашку, в которой в каждой лунке будет находиться раствор с ДНК одного из образцов. Главное - вести запись, где какой образец! Потом будет поздно. В одной из такой лунок находился и образец с моей кожи на лбу.


Далее необходимо амплифицировать (умножить количество) целевую ДНК. Так как я готовлю 16S библиотеку, биологи уже поняли, что интересует меня ДНК бактериальных рибосом.

На картинке снизу показано строение бактериальной рибосомы (верхняя) и эукариотической (снизу). Как вы видите, у бактерий малая субъединица рибосомы включает в себя 16S РНК, а мне нужно умножить количество ДНК из извлеченной, ее кодирующую.

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

Почему именно этот ген? Именно по нему очень удобно идентифицировать различные бактерии, так как:

- Есть у всех бактерий

- Достаточно консервативен

- Достаточно варибелен для классификации.

Данный ген состоит из консервативных (одинаковых у всех бактерий) и вариабильных участков, по которым и можно различать бактерии.

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

Обычно используют участки V3-V4 или V4.

Я использовал V4. Для этого можно заказать готовые праймеры - фрагменты РНК/ДНК, способные связываться с целевой ДНК, и необходимые для амплификации ДНК.

Амплификация ДНК осуществляется при помощи ПЦР - полимеразной цепной реакции. Ссылка для ЛЛ: https://ru.m.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%...

Если кратко, то это реакция, которая позволяет строить новые молекулы ДНК на основе ДНК из ваших образцов. Молекулы ДНК состоят из двух цепочек, комплементарных друг другу, и строятся из последовательности 4-х нуклеотидов - аденина, гуанина, цитозина и тимина. Комплементарность - это способность нуклеотидов из разных цепочек образовывать связь друг с другом - аденин связывается с тимином, цитозин - с гуанином, при помощи водородных связей (нуклеотиды внутри цепочки соединены более сильной ковалентной связью). В итоге в одной молекуле ДНК содержатся две цепочки, которые, хоть и содержат разные последовательности нуклеотидов, комплементарны друг другу и на основе одной из них всегда можно построить другую.

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

При этом цепочки антипараллельны друг другу - представьте это как два поезда на станции, которые должны отправиться в разные стороны и пока стоят рядом на путях. То есть начало одной цепочки находится рядом с концом другой и наоборот. Это важно, так как строение новой цепочки на основе старой может идти только в одном направлении.

Для ПЦР готовят смесь из ДНК, праймеров, полимеразы (фермент, который строит ДНК), и нуклеотидов. Реакция проводится в амплификаторе, или ПЦР-машине, способной периодически нагревать и остужать смесь.

Так вот, при ПЦР молекулы ДНК нагреваются примерно до 95 градусов, при этом относительно слабые водородные связи между двумя цепочками разрушаются, и они расходятся. Тут нам и пригодятся праймеры - при остывании смеси ДНК может восстановить водородные связи, и праймеры заранее подбираются таким образом, чтобы связаться с нужным нам фрагментов ДНК по принципу комплементарности, затем полимеразы достраивают из нуклеотидов новые цепочки ДНК на основе старых. И так 25-35 циклов подряд.

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

На выходе имеем опять таки плашку с разными образцами в каждой лунке, но теперь ДНК в основном состоит из целевых фрагментов, в моем случае - V4 из РНК бактериальной малой субъединицы рибосомы.


После ПЦР проводится прикрепление меток - баркодов, в каждой лунке - свой баркод. Получается, что-то типа такой таблицы


Образец 1 - баркод 1

Образец 2 - баркод 2.


Каждый баркод имеет свою уникальную последовательность ДНК, которая при помощи ещё одной ПЦР реакции прикрепляется к амплифицированным при первой ПЦР молекулам ДНК.

После того, как баркоды добавлены, можно объединить все образцы в одну пробирку и секвенировать - прочитать последовательность нуклеотидов в ДНК. Я работал на ISeq. Фото с нета.

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

После секвенирования я могу скачать архив архивов, каждый из которых содержит имя одного из моих образцов. Для этого и нужны были баркоды - машина считала ДНК из общей кучи, а потом разделила по архивам согласно баркодам.

Данные архивы я обрабатывал программой Qiime2,  специально разработанной для изучения микробиомов. Эта программа, или, вернее, среда - настоящий комбайн, с помощью которого можно посчитать статистику, корреляции, определить таксономию, и так далее.  И все - бесплатно.

Здесь приведу очень краткий пример, только для одного образца, поэтому 95% функционала Qiime2 здесь показано не будет, только пример таксономической классификации бактерий.

Машина с Ubuntu 18.04 и Qiime2-2019.04 на борту.

Активирую среду в терминале и запускаю Jupyter lab (команды можно запускать и с терминала, но лаб намного удобней)

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

В браузере открывается такое окно. На скрине я уже набрал код для импортирования моих данных в программу. У программы есть сайт, который легко гуглится, с мануалами, туториалами и активным форумом, где вам всегда помогут.

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

После этого ввожу команды для удаления праймеров из последовательностей ДНК

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

Если нужно, последовательности, считанные с противоположных концов одного фрагмента одной ДНК, объединяются в одну последовательность и фильтруются

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

Теперь можно и классифицировать бактерии. Для этого нужна датабаза известных 16S  ДНК бактерий - я скачал с сайта Silva последнюю и натренировал на ней ранее классифайер (по инструкциям с сациа), который и использовал на своём образце

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика
Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

В итоге я знаю, какие бактерии живут у меня на лбу

Маленькие бактерии и лбы, на которых они обитают ДНК, Бактерии, Длиннопост, Лаборатория, Наука, Биология, Биоинформатика

Да, там есть хлоропласты, и я подозреваю, что частично я - растение. Ну или просто слишком много возился с растениями в тот день=).


PS - малое количество бактерий, так как я едва провел палочкой по лбу, и моя задача была проверить, смогу ли я использовать этот набор для почвы для обработки swab образцов - в принципе, можно. В образцах из почвы я получил данные по сотням бактерий с той же библиотеки, и с ними сейчас работаю в Qiime2  над статистикой, альфа и бета разнообразием и пр.


И да, я пропустил этапы очистки ДНК после пцр и нормализацию ДНК, так как слишком много бы получилось.


Кто дочитал - я вами восхищаюсь.

Показать полностью 14
1354

Выделение нематод из корней заражённых растений

Написал в одном из комментариев, что работаю с нематодами и под ним попросили сделать об этом пост. На меня неожиданно подписалось 45 человек, и один даже запомнил, зачем:

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Ладно, не отвертишься, пришлось делать. Работать будем с этими ребятами:

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Сразу приведу название публикации, протокол из которой использовал: "Assessing Attraction of Nematodes to Host Roots Using Pluronic Gel Medium".

Как раз прошло достаточно времени с тех пор, как высадил растения в зараженную почву (около месяца).

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Если очистить корни растений, то можно обнаружить узелки, или галлы - именно здесь паразитируют наши нематоды. У нематод есть твёрдый и острый стилет, при помощи которого они могут проникать внутрь молодых отростков корней и передвигаться внутри корня. Оказавшись в подходящей локации внутри корня, нематоды синтезируют определённые ферменты и факторы, провоцирующие активный рост клеток (обычно растут 4 клетки), но при этом блокируют механизмы деления клеток. В итоге образуются так называемые гигантские клетки, которые мы и можем разглядеть в виде узелков.

Не очень хорошо очистил корни, так как не хочу смыть яйца нематод с поверхности узелков.

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Далее необходимо порезать корни на куски поменьше. На фото я уже поместил их в сито.

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Ну а теперь нужно подготовить 2 сито с сечением поменьше - номер 200 (сечение 75 мкм) и 500 (25 мкм). Яйца нематод, с которыми я работаю, примерно 90 мкм в длину и 45 мкм в диаметре, так что при промывании корней водой они легко пройдут через сито 200 и останутся на сито 500.

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Корни заливаются сначала 0.6% раствором хлорки, и активно "трясутся" для того, чтобы яйца отцепились от узелков. Сами нематоды живут внутри узелков, но яйца откладывают на их поверхность. После промываются обычной водой.

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Я предпочитаю трясти зачёркнуто(яйцами) корнями в пластиковом сито и сливать воду на другие сито, чем делать это сразу на номере 200, как предлагают в протоколе:

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

После хорошей промывки убираем верхнее сито и видим фракцию всего вымытого размером от 25 до 75 мкм, которую мы аккуратно собираем

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост
Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Подбираем баланс и центрифугируем при скорости 1400 g 5 минут

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост
Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост
Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Далее вся жидкость сливается, остаётся только грязный осадок, который смешивается с 36% раствором сахарозы, сверху доливается пара милилитров воды, и все это опять сентрифугируется 5 минут но уже при скорости 330 g

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост
Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

При такой скорости все тяжёлые примеси уйдут на дно, а более лёгкие яйца нематод вытеснятся 36% сахарозой в воду на поверхности, которую мне и надо собрать

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Далее вода с яйцами нематод промываются 0.6 % хлоркой и потом водой три раза. Получаем такой осадок с яйцами

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

После этого готовим ёмкость с ситом, в ёмкость наливается вода таким образом, что бы её поверхность была чуть выше, чем само сито, и на сито укладывается пара салфеток

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

На салфетки мы и выливаем жидкость с яйцами нематод. Закрываем и подписываем, так как все, что оставлено в лаборатории и не подписано, будет уничтожено лаборантом

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Оставляем в таком виде на три дня, нематоды вылупятся из яиц и залягут на дно до лучших времен. Приложу картинку с прошлой эстракции

Выделение нематод из корней заражённых растений Нематоды, Лаборатория, Наука, Биология, Длиннопост

Уот так уот. Зачем я их выделял? В дальнейшем я буду выделять их них ДНК, готовить 16S библиотеку, секвенировать и анализировать микробиом.

Показать полностью 20
Отличная работа, все прочитано!